弓形虫荧光定量PCR检测方法及HRM分型方法的建立

发布时间：2017-11-25 19:02

本文关键词：弓形虫荧光定量PCR检测方法及HRM分型方法的建立

【摘要】：弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种呈世界性分布的人兽共患寄生性原虫病,病原是真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。该虫可寄生在几乎所有温血动物的有核细胞内,严重危害人类的健康及畜牧业的发展。研究报道:国内猪的弓形虫感染率从12%~100%不等,病死率可达60%以上。弓形虫病正严重危害着中国养猪业的健康发展。目前,该虫有三个国际公认的传统基因型,即TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中TypeⅠ型为强毒基因型,Ⅱ型和Ⅲ型为弱毒基因型。本论文选取TypeⅠ型标准虫株RH株,Ⅱ型标准虫株PRU株及Ⅲ型标准虫株VEG株作为研究对象,以致密颗粒蛋白7(GRA7)基因为靶基因,建立弓形虫病的荧光定量PCR检测方法及弓形虫三种标准虫株HRM基因分型方法,为弓形虫的分子生物学检测、种群遗传学及流行病学调查奠定基础。为建立一种弓形虫病的快速检测方法,在弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因种内保守的区域设计种特异性引物,建立弓形虫病的荧光定量PCR检测方法,并应用于临床检测。结果显示,该检测方法特异性强,除弓形虫阳性样品出现扩增外,猪等孢球虫、猪附红细胞体、新孢子虫、犬钩虫、猫蓝氏贾第虫等没有扩增;操作简单、快速、从提取样品基因组到出检测结果全程需时大概100 min左右;敏感度高、最低可以检测到含1个拷贝靶基因的阳性质粒及含10个速殖子的临床样品;稳定性好,组内及组间Ct值的变异系数(CV)均小于2%。用所建立的检测方法对广东地区9个规模化发病猪场送检的360份临床样品进行检测并结合抽样测序,结果显示该地区这几个规模化猪场的弓形虫感染率较高,样品阳性率高达63.0%,同时提醒养殖场畜主要正确及时使用药物进行控制,加强监测,避免爆发式发病。该方法对猪弓形虫病的流行病学调查及其防治具有一定意义。为建立一种弓形虫三种虫株的快速基因分型方法,本研究选取弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)作为靶基因,采用HRM技术对国际公认的三个传统基因型的标准虫株(TypeⅠ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株)进行基因分型。结果显示,本研究所设计的引物HRM-F和HRM-R,在优化的反应条件下能明显区分TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型。HRM分型方法的稳定性试验结果显示、三次的组内和组间重复性均良好;敏感性试验结果显示,当样品浓度低至5×10-4 ng/μL时,HRM分型方法依然可以辨别出基因型。用所建立的分型方法对9份临床阳性样品进行检测,结果显示4份人源样品和1份鱼源样品为TypeⅡ型,可信度90.82%以上;2份猴源样品为TypeⅠ型,可信度91.34%以上;其它2份猪源样品未能定出其基因型,推测可能其属于一种地域特有的基因型。本研究所建立的HRM基因分型方法具有快速、稳定、敏感和准确的特点,适用于弓形虫的临床分类研究和分子流行病学调查。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

【参考文献】

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