柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶和保守蛋白CHP317特性的初步研究

发布时间：2017-11-27 08:15

  本文关键词：柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶和保守蛋白CHP317特性的初步研究

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【摘要】：鸡球虫病是危害严重的寄生虫病之一,每年都会给畜禽养殖造成巨大的经济损失,该病是由顶复器门艾美耳属球虫寄生鸡肠道所引起的。柔嫩艾美耳球虫是目前已知的几种艾美耳球虫中致病力最强的一种,可以导致鸡死亡。顶复器门原虫严格营细胞内寄生,它们入侵宿主细胞的机制相对保守,都会在宿主细胞膜与虫体表面形成一个高度保守的运动结构(Moving Junction,MJ),对虫体入侵宿主细胞起关键作用。对弓形虫和疟原虫的研究表明,微线体分泌的顶膜抗原1(AMA1)是组成MJ的重要组分之一,鸡球虫和弓形虫、疟原虫同属于顶复器门原虫,因此深入研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1(EtAMA1)对于理解鸡球虫入侵宿主细胞的机制具有重要意义。本课题组在前期研究中利用酵母双杂交技术筛选了可能与EtAMA1互作的蛋白,本研究选取了EST编号为23(Genbank登录号:JZ905767)和317(Genbank登录号:JZ905773)的两个蛋白,验证其和EtAMA1间的互作关系并对其功能做了初步研究。1.柔嫩艾美耳球虫EtCBS和EtCHP317基因的克隆及生物信息学分析所选的两个EST序列包含3’Ploy A末端,因此利用5’RACE技术扩增获得这两个基因的全长c DNA序列。其中编号为23的基因全长共2423 bp,ORF长1887 bp(201 bp-2087 bp),编码629个氨基酸,预测分子量约68 k Da,既没有跨膜结构也没有信号肽,预测有22个B细胞表面抗原位点,该基因编码的蛋白与柔嫩艾美耳球虫推测的胱硫醚β合成酶(cystathionine beta-synthase)100%同源,因此命名该基因为柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶(EtCBS);基因317全长共1113 bp,其中ORF长501 bp(71 bp-571 bp),编码167个氨基酸,预测分子量大小约18 kDa,无跨膜结构和信号肽,预测有8个B细胞表面抗原位点,该基因与保守的假象蛋白(hypothetical protein conserved,Etm102F05)100%同源,因此将该基因命名为EtCHP317。QRT-PCR的结果显示EtCBS基因的m RNA在子孢子阶段转录水平最高,EtCHP317基因的m RNA在裂殖子阶段转录水平最高。2.柔嫩艾美耳球虫EtCBS和EtCHP317原核重组蛋白的表达及功能初步研究分别将基因EtCBS和EtCHP317的ORF克隆至原核表达载体p ET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在16℃下经IPTG成功诱导表达了重组蛋白His-EtCBS(rEtCBS)和His-EtCHP317(rEtCHP317),其中两种重组蛋白均以可溶性形式表达。分别利用亲和层析纯化蛋白并用其免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用间接免疫荧光(IFA)对EtCBS和EtCHP317在虫体不同发育阶段分布进行亚细胞定位分析,其结果显示:EtCBS主要位于子孢子和裂殖子的表面,当子孢子入侵DF-1细胞时,该蛋白位于顶端,且随着虫体在细胞内的发育,含量也逐渐增多,推测该蛋白可能与虫体的发育和入侵有关。而对EtCHP317的定位发现,其主要也位于子孢子和裂殖子的表面,当子孢子入侵DF-1时,该蛋白主要位于虫体顶端和表面,推测该蛋白可能和虫体入侵相关。体外抑制实验结果显示:随着抗体浓度的增加,与正常对照组相比,anti-rEtCBS和anti-rEtCHP317抗体作用后的虫体入侵能力显著下降,当抗体浓度达到400μg/m L,可以抑制约70%的虫体入侵细胞,因此,推测这两个蛋白在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中可能发挥着重要功能。3.柔嫩艾美耳球虫EtCBS蛋白和EtCHP317蛋白与EtAMA1蛋白互作关系的验证本研究分别将EtCBS与EtCHP317连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)和pBiFC-VN155上,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1-EtCHP317、pcDNA3.1-EtCBS、pBiFC-VN155-EtCBS和pBiFC-VN155-EtCHP317,且能在真核细胞DF-1中成功表达。为了验证EtCBS、EtCHP317和EtAMA1间的相互作用,将EtCBS和EtAMA1与EtCHP317和EtAMA1真核表达质粒分别共转染DF-1细胞,利用Co-IP方法将抗FLAG标签的抗体偶联到载体上,通过抗体与目的蛋白之间的互作间接将目的蛋白沉淀出来,从而验证蛋白之间的互作,结果说明EtCBS和EtAMA1不存在相互作用,而EtCHP317和EtAMA1间存在相互作用。同时利用双分子荧光互补实验(BiFC)验证了EtCBS和EtAMA1与EtCHP317和EtAMA1的互作关系,BiFC的结果显示,两个实验组中EtCBS实验组无绿色荧光,而EtCHP317这一组可以观察到特异绿色荧光,因此EtCBS和EtAMA1不存在相互作用,而EtCHP317和EtAMA1间存在相互作用。GST Pull-Down实验结果也同样证实了这一结论。4.柔嫩艾美耳球虫rEtCBS和rEtCHP317的动物免疫保护性实验将120只7日龄雏鸡平均分成六组,20只鸡为一组,分别为健康对照组、感染对照组、rEtCHP317(50μg/羽)+ISA71、rEtCHP317(100μg/羽)+ISA71、rEtCBS(50μg/羽)+ISA71、rEtCBS+ISA71(100μg/羽)。感染对照组免疫佐剂ISA71,其他实验组按照相应的剂量在7日龄、14日龄时进行皮下免疫。二免8 d后除了健康对照组外,每只鸡经口接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊一万个,攻虫后9 d结束实验。通过对鸡的增重、盲肠病变的情况以及卵囊排出量等指标综合评价疫苗效果。结果显示,和感染对照组相比,实验组在增重、盲肠病变以及卵囊产出方面均有所改善,说明重组蛋白对抵抗球虫入侵有一定的效果,可以增强机体抵抗球虫感染的能力。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

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本文编号：1231183