LysP45联合纳米氧化锌抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究

发布时间：2017-11-29 02:20

  本文关键词：LysP45联合纳米氧化锌抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究

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【摘要】：金黄色葡萄球菌是重要的人畜共患病病原菌,可引发多种感染疾病,譬如奶牛乳腺炎和子宫内膜炎等,极易造成奶牛繁殖障碍,对奶牛产业影响巨大。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现给这些感染性疾病的临床治疗带来了极大的困难,对人畜生命健康造成极大威胁,亟待寻求新的治疗方法。噬菌体是一种以细菌为宿主的病毒,它们通过自身产生的裂解酶裂解细菌的细胞壁,从而杀死细菌。因此,噬菌体和裂解酶在治疗耐药性葡萄球菌感染疾病方面表现出巨大的应用潜力。但是,裂解酶存在保存周期短,作用时效短等缺点限制了其应用。纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌也有较好抑菌效果,也可作为良好的酶固定化载体。本研究分离筛选针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的烈性噬菌体,并对其裂解酶进行表达,进一步探索裂解酶杀菌活性及其与纳米氧化锌联合对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的可行性,并分析纳米氧化锌对裂解酶抑菌活性和稳定性的影响。试验一以本实验室分离保存的金黄色葡萄球菌菌株为宿主菌,进行了噬菌体的分离、纯化和鉴定,通过宿主范围研究,进一步筛选出一株具有杀菌谱广、裂解活性强的烈性噬菌体,命名为P45,并对其生物学特性进行了研究,包括最佳感染复数,一步生长曲线,形态学观察等指标。通过透射电子显微镜对其进行形态学观察,P45属于肌尾噬菌体科,有长约150 nm、直径约30 nm的尾巴,头部呈直径50±5 nm正六边形。通过效价分析,确定P45对金黄色葡萄球菌菌株SA45的最佳感染复数为0.01。获取的一步生长曲线中,P45潜伏期仅为20 min,爆发很快,具备烈性噬菌体的典型特征。试验二通过克隆裂解酶基因,体外表达得到高纯度裂解酶蛋白(LysP45),摸索分析得到裂解酶的最佳作用条件和杀菌活性,确定杀菌谱。PCR获得了P45的裂解酶基因,长度为1488bp,并对裂解酶LysP45进行了体外表达和纯化。LysP45对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出很强的裂解能力,它的最佳作用温度和pH分别为37°C和7.0。裂解酶LysP45具有更广的裂解谱,被检的21株金黄色葡萄球菌均会被其裂解,对溶血葡萄球菌也有较高的裂解活性,但对其他菌株(大肠杆菌,乳酸杆菌和沙门氏菌)没有杀菌活性。试验三为了弥补裂解酶时效短、稳定性差的不足,分别测定了纳米氧化锌,纳米二氧化钛和纳米二氧化硅对裂解酶LysP45活性及稳定性的影响。其中,纳米氧化锌能够显著地抑制金黄色葡萄球菌SA45的生长,其最低抑菌浓度为0.08 mg/ml。此外,纳米氧化锌还能大大提升裂解酶LysP45的裂解活性:相对于LysP45的单独使用,与纳米氧化锌联合时产生的抑菌圈直径增加了3.1mm。在稳定性方面,与纳米氧化锌联合使用的LysP45在4℃储存20天后,其对金黄色葡萄球菌SA45的杀菌活性仍能保持在80%以上,而单独的Lys P45在4℃储存10天后,其杀菌活性就下降到50%,并在储存18天后丧失杀菌活性。综上所述,纳米氧化锌可以有效提高LysP45的杀菌性能及其稳定性。在本研究中,获得的噬菌体裂解酶LysP4具有广谱高效的杀菌活性,当添加纳米氧化锌与LysP45联合时,LysP45表现出更强的裂解活性,且稳定性也得到了大幅度的提升,因此纳米氧化锌可以作为裂解酶较好的酶固定化材料。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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本文编号：1235852