产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及间接ELISA的建立与应用

发布时间：2017-11-30 19:47

  本文关键词：产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及间接ELISA的建立与应用

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【摘要】：根据Gen Bank已登录的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,设计并合成针对成熟肽的特异性引物。以C型产气荚膜梭菌总DNA为模板,PCR扩增α毒素成熟肽基因片段,构建原核表达重组质粒p ET-28a(+)-α。通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,将阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达、镍柱亲和层析纯化蛋白、尿素梯度透析复性后,Western-blot鉴定表达产物。使用复性的重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA的试验条件,确定最佳反应条件。正交试验结果表明,抗原最佳包被浓度为5.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶50,酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000。采用已确定的间接ELISA的反应条件,对108份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA的判定标准,即D450≥0.393为阳性,D4500.393为阴性。采用已建立的间接ELISA对58份阴性血清和50份阳性血清进行检测,结果表明建立的间接ELISA的特异性为96.5%,敏感性为98%。采用本试验建立的产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA对陕西省不同山羊场的521份山羊血清进行了检测,阳性率为92.7%。上述结果表明,该间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用为产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。
【作者单位】： 西北农林科技大学动物医学院;
【基金】：陕西省科技攻关项目(2015NY162) 西北农林科技大学试验示范站(基地)科技成果推广项目(TGZX2015-32)
【分类号】：S852.61
【正文快照】： 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)又称魏氏梭菌,在自然界分布广泛。该菌属于一种条件致病菌,致病作用主要在于它所产生的毒素。迄今为止,已经发现的外毒素至少有20种[1],其中主要致死毒素为α、β、ε和ι。根据产生主要致死毒素(α、β、ε和ι)的不同可将产气荚膜梭菌

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本文编号：1240310