多表位重组抗原的研制及在日本血吸虫病诊断和免疫预防上的初步应用

发布时间：2017-12-02 02:08

  本文关键词：多表位重组抗原的研制及在日本血吸虫病诊断和免疫预防上的初步应用

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【摘要】：日本血吸虫病(schistosomiasis)仍然是我国重要的公共卫生问题之一。病牛是我国血吸虫病最重要的传染源,在某些流行区内羊在血吸虫病传播中的作用也不可忽视,有效控制牛、羊血吸虫病对我国早日阻断血吸虫病传播将有重大的意义。诊断是血吸虫病防控中的中心环节。在现已建立的各种血清学诊断技术中,血吸虫虫卵可溶性抗原SEA是最常用的诊断抗原,但以SEA作为诊断抗原,往往特异性较差,交叉反应高,不能区分现症感染和既往感染以及不能作为疗效考核的诊断抗原。一些血吸虫重组抗原已被用作诊断抗原或疫苗候选分子,评估其应用前景,但大多数重组抗原获得的敏感性都低于SEA,诱导的保护效果都不够高或不稳定。多表位重组抗原含有多个抗原表位有可能增强其抗原性和免疫原性,把它们作为诊断抗原或疫苗候选分子,有可能提高诊断方法的敏感性和疫苗的免疫保护效果。基于此,本文开展了以下几个方面的研究:1.候选抗原SjPGM和SjRAD23细胞表位的分析及单分子和多表位重组抗原的构建应用BepiPred 1.0、T-epitope Designer、PredictProtein、IEDB Analysis等在线预测软件预测候选抗原SjPGM和SjRAD23的B细胞和T细胞表位及候选抗原肽段的抗原性、可接近性等,综合各个预测软件的分析结果,筛选出表位富集肽段三段,包括从SjPGM挑选出的BSjPGM(aa 85-166);Sj RAD23挑选出的BSj RAD23-1(aa 46-123)和BSjRAD23-2(aa 166-230)。另Sj23抗原的大亲水区(LHD-Sj23)也被引入作为候选表位富集肽段。设计特异性引物,共构建了9种重组原核表达质粒,其中包括4种单分子重组表达质粒:BSjPGM/p ET-28a(+)、BSj RAD23-1/pET-28a(+)、BSjRAD23-2/p ET-28a(+)、BSj23/p ET-32a(+)和5种多表位重组表达质粒:BSjPGM-BSj23/p ET-28a(+)、BSjPGM-BSj RAD23-1/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj23/p ET-28a(+)和BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)。除BSjPGM/p ET-28a(+)、BSjRAD23-2/p ET-28a(+)、BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)外,其余6种重组表达质粒均成功在大肠杆菌中表达,并经纯化获得条带单一的目的蛋白。2.单分子/多表位重组抗原用于诊断山羊血吸虫病的初步研究以重组抗原rSjPGM和rSj RAD23及新构建的6种表位重组蛋白作为诊断抗原,以sea作为参照抗原,应用间接elisa方法检测山羊日本血吸虫病,共检测91份山羊感染日本血吸虫血清,44份健康山羊血清,12份捻转血矛线虫感染血清及37份东毕吸虫感染血清。结果显示,除rbsjpgm-bsjrad23-1外,其余3种多表位重组抗原获得的敏感性都高于4种单分子重组抗原(rsjrad23,rsjpgm,rbsjrad23-1,rbsj23),其中多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23获得最高的敏感性(97.8%,89/91),且保持良好的特异性(100%,44/44)和较低的交叉反应性(捻转血矛线虫:8.33%,1/12;东毕吸虫13.51%,5/37)。而以sea作为诊断抗原,其敏感性为100%(91/91),但特异性仅为75%(33/44),且与捻转血矛线虫和东毕吸虫分别有25%(3/12)和83.78%(31/37)的交叉反应。本研究结果显示,多表位重组抗原的研制与应用有可能提高重组抗原检测山羊血吸虫病的敏感性,多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23有可能是一种诊断山羊血吸虫病的优选抗原。3.单分子/多表位重组抗原用于诊断水牛血吸虫病的效果评估将在诊断山羊血吸虫病中显示出较好效果的5种重组表位抗原,包括2种单分子表位抗原(rbsjrad23-1,rbsj23)和3种多表位重组抗原(rbsjpgm-bsj23、rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23、rbsjrad23-2-bsjpgm-bsj23),用于诊断水牛血吸虫病,同样以sea作为参照抗原。共检测114份日本血吸虫感染水牛血清,92份健康水牛血清,14份前后盘吸虫感染血清。elisa结果显示,5种重组表位抗原中rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23获得最高的敏感性(95.61%,109/114),其特异性和交叉反应率分别为97.83%(90/92)和7.14(2/14)。而以sea作为诊断抗原,获得的敏感性为100%,特异性和交叉反应率分别为82.61%(76/92)和50%(7/14)。本研究结果显示,多表位重组抗原的研制与应用可以提高重组抗原检测水牛血吸虫病的敏感性。同样,多表位重组抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23是水牛血吸虫病的优选诊断抗原。4.表位重组抗原诱导免疫保护效果的初步评价在抗原表位分析基础上,本研究构建了一重组表达质粒bsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1/pet-28a(+),将三种重组表位抗原rbsjrad23-1,rbsjpgm-bsjrad23-1,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1结合206佐剂免疫小鼠,结果在两批独立的动物实验中,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1在小鼠中诱导的减虫率(42.7%,30.4%)和减卵率(40.3%,30.3%)均高于另两种表位重组抗原,本研究提示构建多表位重组抗原可提高重组抗原诱导的免疫保护效果。本研究研制了一种在牛、羊血吸虫病诊断中具有较高敏感性和特异性的重组多表位诊断抗原r BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj RAD23-1,并建立了ELISA检测技术,为我国家畜血吸虫病防控提供了一种可选择的诊断新技术。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.9

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本文编号：1243250