产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立及初步应用

发布时间：2017-12-05 17:32

  本文关键词：产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立及初步应用

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【摘要】：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)可产生多种致死性的外毒素,容易引发畜禽的各种产气荚膜梭菌病,以及人们的食物中毒、创伤性气性坏疽,严重影响人们身体健康,给各国的养殖业和公共卫生造成了一定的损失,因此临床上产气荚膜梭菌病的诊断非常重要。目前诊断该病的主要方法为病原菌的分离鉴定、肠内容物的毒素检测,产气荚膜梭菌病主要是由肠源性感染引起,常形成肠源性毒血症,并不一定形成菌血症及败血症,因此从内脏实质器官不一定能分离到细菌,若只从肠道分离到产气荚膜梭菌没有诊断价值;小鼠中和试验检测发病动物肠内容物中的产气荚膜梭菌毒素,已逐渐被更加敏感的ELISA方法所代替,但其作为疾病确诊的依据也受到质疑;特别是A型产气荚膜梭菌引起的疾病,肠道内α毒素的检测及分离到大量产气荚膜梭菌都不能成为确诊的依据,因此迫切需要一种方法能检测产气荚膜梭菌的致病作用以明确诊断。α毒素是各型产气荚膜梭菌均产生的致死性外毒素,尤其以A型菌所产的α毒素量最多。本研究以A型产气荚膜梭菌(NCTC 528)为主要的产毒菌株,进行α毒素的高效厌氧产毒,通过Enterotoxaemia ELISA kit、小鼠半数致死量(LD50)和SDS-PAGE方法测定所产培养物上清中的α毒素;应用所产毒素对试验家兔进行人工腹腔注射、肌肉注射α毒素,及时采集72h内死亡家兔的器官组织:心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠、大脑、小脑和延脑,制备组织切片,用于后续病理组织学检查和免疫组化方法的优化建立。结果显示:所制备的同批次α毒素对小鼠的LD50为2-4.25/m L,对家兔的最小致死量(MLD)为2 m L,即38倍小鼠LD50;人工注射的α毒素通过血液循环致使胃绒毛上皮细胞空泡变性、坏死,小肠、盲肠的肠上皮细胞坏死、脱落,粘膜下层充血,还致使相关重要的实质器官组织出现了充血、出血、红细胞溶血及主质细胞变性、坏死的急性损伤。本研究以抗重组α毒素杂交瘤细胞制备的单克隆抗体(2A11)为基础(抗体效价达1:102400),通过对免疫组化程序中的组织固定、抗原修复、封闭条件、单抗2A11稀释度、酶标二抗和DAB显色等多个试验条件进行摸索和优化,优化建立了单抗介导免疫组化检测方法。该方法可特异性的检测到人工感染兔心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠和延脑中的α毒素分布,其中胃、小肠、肾脏组织中的α毒素信号强度较强,主要分布于主质细胞的细胞质中,这为今后探讨产气荚膜梭菌α毒素的致病机理提供了手段和参考。本试验应用建立的免疫组化法,结合病原分离培养、Multiplex PCR方法,对2013年10月~2015年9月期间采集的山东省5个规模化兔场疑似梭菌性肠炎病例进行诊断,结果显示:本研究共分离到32株产气荚膜梭菌,毒素型均为A型,分离率为64%(32/50)。免疫组化检测显示:在50只疑似感染兔的器官组织中,有47只兔可检测到α毒素,其阳性检测率为94%,在采集的病兔肾脏、肝脏、胃和小肠组织中可检测到α毒素阳性信号。本研究结果表明:山东省部分地区规模化兔场中发生的5起兔腹泻疫情与产气荚膜梭菌的感染高度相关,94%发病兔感染了兔梭菌性肠炎,78.7%的发病兔出现了产气荚膜梭菌肠毒血症,流行的产气荚膜梭菌的毒素型为A型;免疫组化法检测疑似梭菌性肠炎病兔组织中α毒素的阳性率显著高于病原菌的分离率,因此所建的免疫组化法可以弥补常规病原菌分离鉴定的不足,为本病的诊断提供更加可靠的依据。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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