圈养食蟹猴腹泻致病菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

发布时间：2017-12-06 01:12

  本文关键词：圈养食蟹猴腹泻致病菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

  更多相关文章： 圈养食蟹猴 腹泻致病菌 分离鉴定 沙门氏菌 志贺氏菌 变形杆菌 PCR

【摘要】：圈养食蟹猴细菌性腹泻在临床上非常普遍。为了认识和了解圈养食蟹猴腹泻致病菌的种类,本研究首先采取传统的方法对腹泻致病菌进行分离纯化,然后采用16S rRNA基因序列分析方法对部分细菌进行鉴定；最后对3种腹泻重要致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌和变形杆菌)建立3重PCR检测方法,并对3重PCR体系反应条件进行优化。实验内容及结果如下：1、采用传统的方法从85份圈养腹泻食蟹猴的粪便样品(肛拭子)中分离到112株细菌。利用细菌16S rRNA基因序列的通用引物对其中11株进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序鉴定,并对其中10株补充做生化实验。结果表明：11株细菌中包括1株未培养细菌,1株沙门氏菌,2株鲍氏不动杆菌,1株奇异变形杆菌,1株普通变形杆菌,1株潘氏变形杆菌,1株金黄色葡萄球菌,1株吉氏库特氏菌,1株大肠杆菌,1株志贺氏菌。2、本研究针对沙门氏菌fimY基因,志贺氏菌iPaH,以及变形杆菌atpD基因,从参考文献中选取3对特异性引物组合在一起,建立一种同时检测沙门氏菌、志贺氏菌和奇异变形杆菌的多重PCR检测方法,并对多重PCR反应条件进行优化,以及对这个体系的特异性,敏感性等进行检验,最后用优化后的3重PCR体系对人工染菌的30份粪便样品进行检测。建立的3重PCR检测体系条件优化的结果表明：最佳体系为40μL;在体系中包含EasyTap PCR SuperMix 20μL;最适合的上、下游引物添加量为：变形杆菌0.7 gL,沙门氏菌和大肠杆菌均为1μL；最适合的退火温度为58℃；3种菌DNA各1μL；双蒸加至40μL。反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30s；58℃退火45 s;循环数为35；72℃延伸45 s；72℃再延伸7 min。3、PCR引物特异性实验结果显示：只有加有目的基因的泳道出现特异性条带。测序结果比对后表明：扩增序列与沙门氏菌,志贺氏菌,奇异变形杆菌的同源性分别为100%,100%,99%。PCR敏感性试验结果显示：优化后的多重PCR体系检测单一病菌的最低限度为：沙门氏菌1 pg/μＬ；志贺氏菌1 pg/μL；奇异变形杆菌100fg/μL。该多重PCR检测体系同时检测三种致病菌的最低检出量为10 Pg/μL。4、该多重PCR检测系统对人工染菌样品检出率为100%。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.9

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 司红彬,李海洲,贾艳华,张万江,胡功政;志贺氏菌的耐药性研究及防治对策[J];畜牧兽医杂志;2005年04期

2 邱索平;凌华枢;陈文;;食蟹猴肠道志贺氏菌的分离和鉴定[J];安徽农业科学;2007年33期

3 陈希文;郭晓萍;王雄清;邓燕;蒲中慧;马缨;;圈养猕猴志贺氏菌的分离鉴定及药敏分析[J];四川动物;2012年02期

4 庞歌;李娜;周敏;刘艳美;;志贺菌分子生物学检测方法研究现状[J];河南农业;2014年02期

5 张丹鹤;蒋媛媛;许兰菊;杨永珍;邓久虎;苗银萍;;鸡源福氏志贺氏菌的分离鉴定及药敏试验[J];河南农业大学学报;2011年01期

6 高凤山;胡桂学;;幼犬志贺氏菌感染的微生物学诊断[J];安徽农学通报;2007年03期

7 盘宝进,罗兆飞,符明泰,陆红玉,杨爱婵,黄卫宣;出口食蟹猴志贺氏菌的分离和初步鉴定[J];广西畜牧兽医;2002年02期

8 梁军;胡功政;苑丽;司红彬;杨玉荣;匡秀华;;志贺氏菌对第三代头孢菌素的耐药机制初步研究[J];中国预防兽医学报;2006年01期

9 盘宝进;汪文龙;谢永平;韦梅良;罗兆飞;陈立标;;实验猴志贺氏菌检出、血清分型及药物敏感性试验[J];广西农业科学;2006年03期

10 徐义刚;李丹丹;刘忠梅;吴岩;李苏龙;魏冬旭;;应用DPO-PCR方法特异性检测志贺氏菌[J];中国畜牧兽医;2014年03期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 杨宇容;;食蟹猴(Macaca fascicularis)肠道志贺氏菌感染情况的调查[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年

2 陈红远;王丽;钟青萍;;环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌[A];2010第二届中国食品安全高峰论坛论文集[C];2010年

3 詹学佳;唐潍潞;赵广英;;一次性酶免疫传感器快速检测福氏志贺氏菌的研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

4 李雅s，

本文编号：1256834