绵羊ACSL1基因克隆和表达及其对脂肪含量的影响

发布时间：2017-12-08 00:12

  本文关键词：绵羊ACSL1基因克隆和表达及其对脂肪含量的影响

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【摘要】：长链脂酰辅酶A合成酶家族(long-chain fatty acyl-CoA synthetases,ACSLs)是哺乳动物利用脂肪酸活化催化生成酯酰辅酶A过程中所必需的酶。研究表明ACSLs在甘油三酯、磷脂和胆固醇的合成以及脂肪酸的代谢中具有关键作用。本研究根据Genebank中已发表预测的绵羊的ACSL1基因的序列信息,通过序列比对,以公共序列为靶序列,设计引物,扩增出部分编码区(Coding sequence,CDS),再采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNARACE技术分别向两端扩增,最后克隆得到了长度为2100bp的完整CDS区2100bp、1481bp的3’端以及部分5’端序列,共3638bp。其中CDS区共编码699个氨基酸,理论分子质量为82.76kD,理论等电位点为5.38,为疏水性蛋白,无信号肽,不属于分泌蛋白,经序列对比发现其与牛和猪的同源性为97%。利用实时荧光定量PCR检测绵羊ACSL1基因在不同组织中的转录差异,结果显示,ACSL1基因在不同的组织中转录水平不同,肝组织中的转录量显著高于其他组织,其他组织的表达量从高到低依次为心,皮下脂肪,背最长肌,十二指肠,肾,肺,脾,睾丸。利用分子克隆技术构建了绵羊ACSL1基因的RNA干扰载体以及过表达载体,由脂质体介导转染体外分离的绵羊前体脂肪细胞,经过G418筛选获得转基因细胞,利用荧光定量PCR检测绵羊ACSL1mRNA水平变化,发现过表达载体和RNA干涉载体Ⅰ可有效对ACSL1基因进行转录和调控。使用甘油三酯试剂盒对细胞中甘油三酯含量进行检测,结果显示:ACSL1基因过表达后可显著提高绵羊前脂肪细胞的甘油三酯的含量,抑制ACSL1基因表达后则显著降低了甘油三酯的含量。表明ACSL1基因可能在调节动物脂肪代谢中具有重要作用。对ACSL1基因的多态性检测显示,第2外显子在chr.26 13930064位置存在G-A的突变。第14外显子在chr.26 13929965位置存在C-T的突变。第18外显子在chr.26 13922514位置存在G-A的突变。在内含子中也发现了5处突变。结合肉质性状进行了相关分析,发现第2外显子的突变位点对部分脂肪酸及氨基酸含量有影响。第14外显子的突变位点对部分氨基酸和营养成分含量有影响。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826

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1 曹阳;绵羊ACSL1基因克隆和表达及其对脂肪含量的影响[D];吉林农业大学;2016年

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本文编号：1264318