猪瘟病毒结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的调控

发布时间：2017-12-09 00:08

  本文关键词：猪瘟病毒结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的调控

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【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度传染性病毒性疾病,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的动物传染病之一,我国将其列为二类动物疫病。天然免疫应答是机体对入侵病原体的第一道防线,但目前对CSFV结构蛋白在应对机体天然免疫应答机制中的作用尚不清楚。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)能识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),介导天然免疫,产生干扰素(IFNs)、趋化因子和促炎性细胞因子,以清除入侵的病原微生物。关于CSFV与TLRs相互作用机制主要集中于CSFV的感染导致免疫细胞的激活及Ⅰ型IFNs、促炎性细胞因子的分泌。本研究分析猪瘟病毒结构蛋白与TLRs(TLR2、TLR3、TLR4和TLR7)介导的天然免疫应答间的关系,以及对其下游免疫效应分子表达的影响。因此,我们构建CSFV结构蛋白慢病毒载体,利用慢病毒包装系统使CSFV结构蛋白在猪肺泡巨噬细胞中过表达,检测其对TLRs及免疫效应因子表达的影响,了解CSFV结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞TLRs介导天然免疫应答的影响。研究结果如下:1.设计CSFV结构蛋白的引物,在C端引入“Flag”标签,RT-PCR扩增得到CSFV结构蛋白(C、Erns(E0)、E1和E2)基因,与慢病毒载体pCD513B连接,获得4个重组质粒pCD513B-C-Flag、pCD513B-Erns-Flag、pCD513B-E1-Flag和pCD513B-E2-Flag。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建重组质粒。2.利用慢病毒包装系统将重组质粒转染HEK 293T细胞,产生重组慢病毒。将包装好的重组慢病毒颗粒感染猪肺泡巨噬细胞,倒置荧光显微镜观察和Western blot检测,确定CSFV结构蛋白在猪肺泡巨噬细胞中过表达。3.用过表达CSFV结构蛋白的猪肺泡巨噬细胞研究结构蛋白与TLRs信号通路间的关系。结果表明,C蛋白能增强TLR2、TLR3、TRIF和MyD88的表达,主要通过TLR2和TLR3的信号通路激活天然免疫;Erns蛋白能促进TLR3、TRIF和IRF3表达,并抑制MyD88表达,主要影响TLR3信号通路;E1和E2下调MyD88、IRF7和NF-κB的表达,抑制MyD88介导的TLRs信号转导通路。综上所述,本研究构建CSFV结构蛋白慢病毒载体,利用慢病毒包装系统使CSFV结构蛋白在猪肺泡巨噬细胞中过表达,初步了解了CSFV结构蛋白与TLRs(TLR2、TLR3、TLR4和TLR7)介导的天然免疫应答间的关系,为进一步深入研究奠定了基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

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本文编号：1268344