猪溶素与岩藻糖在红细胞膜上的相互作用及仔猪免疫试验

发布时间：2017-12-14 14:16

  本文关键词：猪溶素与岩藻糖在红细胞膜上的相互作用及仔猪免疫试验

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【摘要】：猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病原性细菌,人感染猪链球菌后引起脑膜炎、关节炎、心肌炎,甚至导致休克死亡。1998年和2005年在我国发生的两次猪链球菌疫情中链球菌中毒性休克综合征的发病率明显高于世界其它国家。目前,猪溶素(Suilysin,SLY)是猪链球菌唯一已知的分泌性蛋白质毒素,与人发生链球菌中毒性休克综合征有关,它能裂解红细胞、刺激巨噬细胞释放大量炎性细胞因子,也能引起实验动物产生强烈的炎症反应。猪溶素也是一种保护性抗原,基因修饰的无毒突变子能刺激小鼠产生免疫保护作用。猪溶素属于胆固醇依赖性细胞裂解毒素(Cholesterol dependent cytolysins,CDCs),具有CDCs分子的典型晶体结构。CDCs分子以产气荚膜梭菌溶血素O为原型毒素。长期以来,学界认为CDCs分子结合到细胞膜表面的胆固醇后自动寡聚化形成环状复合物,继而以打孔的方式裂解细胞。但近年来对Intermedilysin(ILY)、Vaginolysin(VLY)及Pneumolysin(PLY)与细胞的相互作用研究打破了胆固醇是CDCs唯一受体的论断。研究发现ILY、VLY特异性结合人CD59分子,PLY与Lewis X有较高的亲和力,Kd值为1.88×10-5 M。由于SLY~(P353L)突变子不能裂解红细胞而是凝集红细胞,而且胆固醇不能完全阻断SLY~(P353L)与红细胞膜的结合,说明SLY可能与ILY、VLY等CDCs分子相似,与红细胞间存在多个结合位点。本研究分析了单糖与SLY的相互作用,并对仔猪进行rSLY~(P353L)亚单位疫苗免疫,结果如下:1.rSLY、rSLY~(P353L)在红细胞膜上有不同的存在形式将rSLY,rSLY~(P353L)与红细胞悬液孵育后,收集经rSLY裂解的红细胞膜碎片、rSLY~(P353L)凝集的红细胞用低渗缓冲液处理后收集膜碎片。将rSLY-膜复合物、rSLY~(P353L)-膜复合物经SDS—AGE凝胶电泳后进行蛋白质免疫印迹检测(一抗为兔抗rslyp353ligg),结果显示,rsly在红细胞膜上以单体、二聚体及寡聚体形式存在,而rslyp353l在红细胞膜上仅存在单体形式。2.单糖对rsly、rslyp353l活性的影响分析上述实验结果并查阅其它文献资料,初步推测sly可能结合红细胞表面除胆固醇外的其它受体分子,特别是糖基化受体。用岩藻糖、甘露糖、葡萄糖进行阻断试验,结果表明,278mmol/l的三种糖溶液能够阻断2haurslyp353l的凝血活性和2hursly的溶血活性;当糖浓度低于139mmol/l时,只有岩藻糖溶液有阻断作用;当糖浓度低于70mmol/l时三种糖溶液均无阻断作用。278mmol/l的三种糖溶液均不能阻断16haurslyp353l的凝血活性和16hursly的溶血活性。因此,岩藻糖溶液的阻断作用最强。用岩藻糖苷酶水解红细胞膜表面的岩藻糖残基后,rslyp353l的凝血活性降低2倍,rsly的溶血活性也有所降低。3.岩藻糖对rsly、rslyp353l与红细胞膜结合作用的影响将rsly、rslyp353l分别与胆固醇溶液、岩藻糖溶液、胆固醇和岩藻糖混合溶液孵育30min后,加入2%的红细胞悬液,再孵育1h。收集红细胞并洗涤,经低渗缓冲液裂解后,收集rsly-膜复合物、rslyp353l-膜复合,经sds—page电泳及蛋白质免疫印迹检测,结果发现:胆固醇能完全阻断rslyp353l凝血活性,少量rslyp353l依然可以结合到红细胞膜上,但结合量少于岩藻糖阻断组;胆固醇与岩藻糖阻断组中红细胞膜上未检测到rslyp353l。对于rsly有相似的结果,但岩藻糖难以完全阻断其溶血活性。4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定rsly、rslyp353l与单糖的亲和力制备含岩藻糖、甘露糖、葡萄糖的非变性聚丙烯酰胺凝胶(凝胶浓度12%,单糖浓度110mmol/l),rsly、rslyp353l样品在冰水混合物浴下电泳,以不含糖的非变性胶为对照。测定rsly、rslyp353l在非变性凝胶中的迁移距离,计算迁移率。结果表明rsly、rslyp353l在含有岩藻糖的凝胶中迁移率分别降低1.7%和2.7%;rsly在含有甘露糖和葡萄糖的凝胶中迁移率均降低了1%,rslyp353l均未降低。5.预测rslyp353l与岩藻糖相互作用的位点通过ncbi和zinc获取rslyp353l与岩藻糖的晶体结构数据,利用clcdrugdiscoveryworkbench2计算可知rslyp353l存在9个可能的bindingpockets,与l-fucose晶体结构比对后所最高得分值为93.2%。岩藻糖最佳结合位点可能是在rslyp353l的第一结构域,通过与tyr98,pro99和val150形成氢键结合到rSLY~(P353L)分子上。6.仔猪免疫的免疫试验以氢氧化铝凝胶为佐剂制备rSLY~(P353L)亚单位疫苗,分三组进行免疫接种试验:每次接种含50μg rSLY~(P353L)的疫苗,接种两次;每次接种含150μg rSLY~(P353L)的疫苗,接种两次;一次性接种含500μg rSLY~(P353L)的疫苗。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫后仔猪血清的抗体效价,结果显示在高剂量一次接种组没有检测到抗体,两次接种组部分仔猪产生特异性抗体,所产生的抗体动态特征有差异,最高效价为1:1024。综上所述,猪溶素与红细胞膜上的岩藻糖存在较弱的相互作用,以氢氧化铝胶为佐剂制备的亚单位疫苗能刺激仔猪产生特异性抗体。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

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