新孢子虫NcMIC2-like1重组蛋白对小鼠新孢子虫感染的免疫保护作用

发布时间：2017-12-17 09:06

  本文关键词：新孢子虫NcMIC2-like1重组蛋白对小鼠新孢子虫感染的免疫保护作用

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【摘要】：新孢子虫是一种细胞内寄生性原虫,宿主范围广,主要感染牛和犬,可造成怀孕母畜的流产、死胎、木乃伊胎。对奶牛的危害尤其严重,被认为是奶牛流产的主要原因之一[1-2],给畜牧业造成了巨大的经济损失。迄今为止,尚无可以有效治疗新孢子虫病的药物,所以免疫预防是目前控制该病的的重要研究方向。本研究以新孢子虫NcMIC2-like1基因作为疫苗候选分子,并将NcMIC2-like1基因与IL-2基因串联,利用原核表达载体pGEX-4T-1表达重组蛋白。制备的新孢子虫重组蛋白NcMIC2-like1和NcMIC2-like1-IL-2免疫小鼠后,测定IgG、IgG1、IgG2a、IL-4和IFN-γ的表达水平。然后对小鼠感染新孢子虫,通过小鼠的存活率、增重率以及脑组织中虫体数量等评价重组疫苗对新孢子虫保护效果。重组质粒pGEX-NcMIC2-like1和pGEX-NcMIC2-like1-IL-2的构建及表达扩增得到NcMIC2-like1基因和鼠IL-2基因,对二者进行克隆和序列比对分析,开放阅读框分别为1134bp、204bp,NcMIC2-like1序列与GenBank收录的新孢子虫Liverpool hypothetical protein(NCLIV_033690)mRNA同源性为100%。鼠IL-2基因核苷酸序列与GenBank收录的鼠interleukin 2(Il2)mRNA(NM_008366.3)同源性为100%。PCR、酶切及测序结果表明成功构建了重组质粒pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1-IL-2。经SDS-PAGE电泳分析,3个蛋白的分子量大小分别约为70KDa、33KDa和74KDa。Western blot鉴定,重组蛋白pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-NcMIC2-like1-IL-2能被小鼠的抗新孢子虫阳性血清特异性识别。重组蛋白NcMIC2-like1和NcMIC2-like1-IL-2抗新孢子虫免疫保护效果对pGEX-NcMIC2-like1-IL-2、pGEX-NcMIC2-like1、pGEX-IL-2重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE电泳分析显示纯化效果较好。重组蛋白免疫小鼠3次后对小鼠血清中IgG及细胞因子水平进行检测。结果显示,pGEX-NcMIC2-like1-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1重组蛋白免疫小鼠后IgG、IgG1和IgG2a均有不同程度提高,同时IL-4和IFN-γ表达水平也有升高,和佐剂对照组及空白对照组相比差异显著(P≤0.05),表明这两种重组蛋白均可以刺激机体产生Th1/Th2免疫应答。攻虫40天后,pGEX-NcMIC2-like1-IL-2组小鼠的存活率是90%,平均增重率80.8%,均显著高于对照组(P≤0.05);pGEX-NcMIC2-like1组小鼠的存活率是70%,平均增重率62.5%,均显著高于对照组(P≤0.05)。提取各组小鼠脑基因组做荧光定量PCR,结果显示pGEX-NcMIC2-like1-IL-2组减虫率为64.7%,pGEX-NcMIC2-like1组减虫率为61.4%,均显著高于对照组(P≤0.05)。pGEX-NcMIC2-like1-IL-2和pGEX-NcMIC2-like1重组蛋白对小鼠的新孢子虫感染有一定的保护效果,且重组蛋白pGEX-NcMIC2-like1-IL-2的保护效果优于pGEX-NcMIC2-like1。因此,IL-2对重组Nc NcMIC2-like1蛋白的免疫保护效果有增强作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.723

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本文编号：1299514