TLRs介导M.bovis感染牛乳腺上皮细胞调控机制研究

发布时间：2017-12-17 11:33

  本文关键词：TLRs介导M.bovis感染牛乳腺上皮细胞调控机制研究

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【摘要】：奶牛乳腺炎为奶牛多发病,在奶牛疾病中占有较高的比例。奶牛养殖业中,每年因乳腺炎造成的损失巨大。牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)作为乳腺炎重要的病原,感染后具有发病时间长、感染率高的特点,并且常伴发关节炎等疾病。众所周知,M.bovis缺少细胞壁结构,因而限制了多种高效广谱抗生素的使用,而且目前实验性M.bovis疫苗免疫保护效果差,针对牛支原体乳腺炎的防治几近 束手无策‖,高效防控牛支原体乳腺炎亟需新思路和新策略。奶牛乳腺具有一套完整的防御外来病原的系统,当病原微生物感染乳腺后,乳腺天然免疫系统立即启动,病原菌经过乳腺乳头管进入乳池后,乳腺内部坚固的城墙-乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)开始发挥哨兵的作用。乳腺上皮细胞含有丰富的的模式识别受体-TLRs,TLRs可以快速识别病原相关分子模式(PAMPs),进而激活宿主细胞启动天然免疫/特异性免疫来消灭入侵者。研究M.bovis与乳腺上皮细胞的相互作用,探讨M.bovis感染乳腺上皮细胞后参与的TLRs种类,以及TLRs如何发挥作用,有助于更好的理解奶牛M.bovis乳腺炎的作用机制,为其高效防治奠定理论基础。本试验旨在建立可靠的M.bovis感染奶牛乳腺上皮细胞的体外模型,通过对感染后TLRs信号通路相关分子转录水平和蛋白水平的研究,确定参与调控M.bovis感染乳腺上皮细胞的天然免疫组分,为解析M.bovis乳腺炎的作用机制提供理论依据,同时也为发掘干预奶牛乳腺炎症药物的新靶标奠定理论基础。本论文主要研究内容和结果如下:1原代BMECs的提取和鉴定从健康奶牛乳腺组织中提取细胞,经角蛋白18免疫荧光鉴定,以及特异性MUC-1基因PCR扩增证实所提取的细胞为原代BMECs。所提取BMECs体外培养生长良好,且无外源支原体污染。2 M.bovis感染BMECs体外模型的建立M.bovis感染可以促进BMECs释放炎性因子IL-6、TNF-α和趋化因子IL-8。根据这些细胞因子的释放情况,结合不同感染条件下BMECs的存活率来确定最佳感染条件。选取乳腺炎源m.bovis临床分离株39yc感染bmecs,同时设置乳腺炎标准株pg45和m.bovis肺炎临床分离株hb0801为两个对照组感染细胞,以未感染m.bovis的bmecs为空白对照(control组),分别以moi=500及1000的感染比(m.bovis:bmecs)感染bmecs,经台盼蓝染色计数以及mtt实验确定细胞存活率,采用qpcr检测il-6、il-8和tnf-α的变化规律,结果表明:(1)感染组在moi为500及1000时,与control组对比,bmecs存活率均未见显著差异;(2)moi=500时,39yc组较control组从感染16h开始到24h,il6、tnf-α的表达量均显著升高(p0.01),il-8的表达量极显著升高(p0.001);pg45组较control组il-6的表达量20h升高出现差异(p0.05),il-8的表达量在感染20h时出现极显著升高(p0.001),感染后16htnf-α的表达量开始升高(p0.05),到24h升高显著(p0.001);hb0801组较control组il-6、il-8以及tnf-α在感染24h均升高极显著(p0.001);(3)moi=1000时,39yc组il-8以及tnf-α的表达量均在感染16h开始升高极显著(p0.001),il-6升高显著(p0.01);pg45组较control组il-6和il-8的表达量在16h开始升高极显著(p0.001),而tnf-α在感染后4h即出现显著升高(p0.01),16h后出现极显著升高(p0.001);hb0801组较control组il-6、il-8和tnf-α在24h均升高极显著(p0.001),20h开始出现升高显著;(4)moi=1000时m.bovis感染bmecs致il-6、il-8和tnf-α表达量升高的程度较moi=500时强。从m.bovis感染bmecs后细胞存活率未见明显变化,三株m.bovis均诱导bmecs产生il-6、il-8和tnf-α等炎性/趋化因子,且炎性/趋化因子产生量呈现感染时间和感染剂量依赖性变化,表明bmecs启动了炎性反应来抵抗m.bovis的入侵,成功建立了m.bovis感染bmecs体外模型。3m.bovis触发bmecs的tlrs筛选及tlrs交叉对话三株不同m.bovis感染bmecs24h,以未感染的bmecs为control对照组,收集不同时间点细胞,分别采用qpcr和westernblot方法在mrna水平和蛋白水平检测感染后触发的tlrs种类。qpcr结果显示:正常bmecs表达除tlr8以外的tlrs(tlr1-10);m.bovis感染bmecs,触发的tlrs有:tlr1、tlr2、tlr3、tlr6和tlr9,详细变化规律如下:(1)感染后10h,39yc组tlr2、tlr3和pg45组tlr9的mrna表达量较control组升高极显著(P0.001),39YC组TLR6升高显著(P0.05);(2)感染后16h,39YC组TLR2、PG45组TLR6、HB0801组TLR2和TLR6的mRNA表达量较control组升高极显著(P0.001);(3)感染后20h,39YC组TLR2及PG45组TLR9的mRNA表达量较control组升高极显著(P0.001),39YC组TLR1升高显著(P0.05);(4)感染后24h,39YC组TLR2表达量、HB0801组TLR9表达量及PG45组TLR2和TLR9的表达量较control组升高极显著(P0.001);Western-blot结果显示:所有感染组中TLR1、TLR2、TLR3、TLR6、TLR9蛋白表达量较对照组均表现不同程度的上调表达。M.bovis感染BMECs,每隔2h收集细胞提取RNA,qPCR检测TLR1、TLR2和TLR6的相对表达量。结果显示:感染后触发BMECs TLR1、TLR2和TLR6的表达呈现一定的规律,TLR1与TLR2的表达趋势类似,同时TLR2与TLR6的表达也存在相似的趋势。为进一步验证TLRs之间的协同作用,分别收集M.bovis感染BMECs 16h和20h的细胞,免疫共沉淀检测TLRs之间的相互作用:三株M.bovis感染均能引起TLR1/TLR2的相互作用以及TLR2/TLR6的互作。4 TLRs下游级联信号通路NF-κB和MAPK的激活TLRs下游信号通路的激活需要接头蛋白的信号传递作用,用三株M.bovis感染BMECs,设置未感染control对照,提取细胞mRNA,qPCR实验结果显示:MyD88和TRIF的表达量都有不同程度的升高。P-P65的表达量的升高以及P-IκBα表达量降低标志着NF-κB信号通路的激活,P-c-Jun表达量的升高标志着MAPK信号通路的激活。Western blot检测M.bovis感染后BMECs P-P65、P-IκBα、P-c-Jun的蛋白表达情况。结果表明:三株M.bovis感染组P-P65、P-c-Jun的表达量均比空白control组高,蛋白P-IκBα的表达量较control组低,且灰度值几乎为零。PDTC为NF-κB的抑制剂,它作用于细胞可以使NF-κB信号通路受阻。采用50μM PDTC预处理细胞1h,之后再用M.bovis感染24h,qPCR检测炎性因子IL-6和TNF-α的释放量,结果显示:PDTC作用后,M.bovis感染BMECs不会引起IL-6、TNF-α表达量的升高,证明M.bovis感染触发了NF-κB信号通路。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

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本文编号：1299987