3型鸭甲肝病毒快速检测方法及对青年鸭侵染规律研究

发布时间：2017-12-22 07:39

  本文关键词：3型鸭甲肝病毒快速检测方法及对青年鸭侵染规律研究　出处：《四川农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：本文对3型鸭甲肝病毒(DHAV-3)的细胞适应和增殖规律、快速检测方法及DHAV-3对青年鸭侵染规律进行了研究,获如下结果：1、DHAV-3的细胞适应和增殖规律DHAV-3在鸭胚成纤维细胞(DEF)盲传至第4代、在鸭胚肝细胞(DELC)盲传至第3代可出现细胞病变。DHAV-3接种DEF后4 h,定量PCR (qPCR)即可检测到DHAV-3,随着时间推移其拷贝数不断增加,到72 h时达到最大值(10~(5.76) copies/μL); DHAV-3接种DEF后4h, TCID_(50)即可检测到DHAV-3,随着时间推移其滴度不断增加,到72 h时达到最大值(10~(4.42)/100μL)。DHAV-3接种DELC后4 h,定量PCR (qPCR)即可检测到IDHAV-3,随着时间推移其拷贝数不断增加,到60 h时达到最大值(10~(7.14)copies/μL); DHAV-3接种DELC后4h,TCID_(50)即可检测到DHAV-3,随着时间推移其滴度不断增加,到60 h时达到最大值(10~(5.75)/100μL). DEF和DELC上清中的DHAV-3的含量低于细胞中的含量。2、SYBR Green I quantitative PCR (qPCR)检测DHAV-3方法建立根据DHAV-3的VP3基因设计一对特异性引物,建立了SYBR Green I quantitative PCR (qPCR)检测方法,其标准方程为Y=-3.317X+36.434,模板浓度在10~2-10~8 copies/μL之间其相关系数为0.996;熔解曲线为单一峰,其它被检测的病原(DHAV-1、 DPV、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鸭疫里氏杆菌)结果为阴性,最低检测限度为102 copies/μL,具有良好特异性和敏感性。用qPCR和TCID_(50)两种方法分别测定DHAV-3在DELC和DEF中的增殖规律,结果表明DHAV-3在DELC和DEF中的增殖趋势一致。3、Real time RT-LAMP检测DHAV-3方法建立根据DHAV-3的VP3基因设计3对引物,建立了real time RT-LAMP检测方法。该方法检测其它病原(DHAV-1、DPV、鸭疫里默氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌)结果为阴性,最低检测限度为104 copies/μL,具有良好特异性和敏感性。RT-LAMP可以定性和定量检测DHAV-3.4、DHAV-3在人工感染青年鸭体内的增殖、分布、排泄规律60只2月龄青年鸭,其中55只肌肉注射含DHAV-3 (10~(15) copies/只)鸭胚尿囊液进行人工感染,于感染后1d、2d、4d、7d、14d、21d、28d、42d、56d、70d,每个时间点选取5只鸭采血后剖杀,采集呼吸器官、免疫器官、消化器官及肠道内容物等,用qRT-PCR检测组织与内容物中DHAV-3的拷贝数。设置空白对照鸭5只,每个时间点采血检测DHAV-3。结果如下：(1)增殖规律：接毒1d-56d, DHAV-3在肝脏中的拷贝数呈现不断上升地趋势,到56d病毒含量最大,0.1 g肝脏中的DHAV-3拷贝数为10~(941) copies,是感染鸭病毒含量最高的器官。(2)分布规律：除气管外,各组织中都检测到DHAV-3,且随着感染时间点的延长,大多数器官中DHAV-3的含量呈现不断增殖趋势。感染后56d, DHAV-3在肺脏、脾脏、十二指肠、脑、心脏、血液中的数量达到最大,其拷贝数分别为10~(7.86) copies、 10~(9.19) copies、10~(8.42)copies、10~(8.71) copies、10~(8.85) copies、10~(7.09) copies,70d病毒拷贝数有所下降。感染后70d, DHAV-3在法氏囊、食管、肌胃、腺胃、空肠、回肠、盲肠、直肠、肾脏、肌肉、中的增殖达到最高峰,其拷贝数在10~(7.57) copies-10~(8.49) copies。在上述器官中,最高峰时DHAV-3在脾脏中含量最高。(3)排泄规律：接毒1d-70d,口腔唾液、胃内容物、肠道内容物、泄殖腔内容物中DHAV-3含量呈现逐渐增长的趋势,70d时达到最高,其拷贝数在10~(5.61) copies-10~(6.92) copies。 DHAV-3在肌胃内容物中含量最小,在空肠内容物中拷贝数最大。5、三种检测DHAV-3方法比较将本研究建立的qPCR和]real-time RT-LAMP与RT-PCR同时检测30个临床样本,结果表明real-time RT-LAMP与RT-PCR的特异性、灵敏性、符合率是一致;real-time RT-LAMP与qPCR的特异性均为100%,灵敏性为84.21%,符合率为90%。qRT-PCR和qPCR只需要1对引物,real-time RT-LAMP需要3对引物。qRT-PCR和qPCR需要90 min-120 min; real-time RT-LAMP需要50min。三种检测方法中以qRT-PCR的特异性、灵敏度最高。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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