宫内发育迟缓（IUGR）猪脐带动静脉血Exosome中microRNA转录组的鉴定和表达谱分析

发布时间：2017-12-23 02:17

  本文关键词：宫内发育迟缓（IUGR）猪脐带动静脉血Exosome中microRNA转录组的鉴定和表达谱分析　出处：《四川农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：脐带血是连接母体与胎儿的纽带,是胚胎发育时期能量、营养物和代谢废弃物的传输通道,能满足胎儿机体生长、发育以及维持机体的健康状态。动物体液中的microRNAs (miRNAs)通常被选择性地包被在exosome中。Exosome是由多种类型的细胞所分泌的带膜囊泡,能将大量特异性的miRNAs主动地定向输送到受体细胞,并调节靶基因的表达和受体细胞的功能。本研究中,在利用原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)证实猪脐带血中存在大量exosome的基础上,构建了具有代表性的同窝出生健康仔猪和IUGR猪的脐带动脉血和静脉血exosome small RNA文库。用高通量测序的方法分析和注解了猪脐带动脉和静脉血exosome中的miRNA表达谱,并用荧光定量方法验证。另外,对在脐静脉和动脉血中高表达的miRNAs以及IUGR与正常猪差异表达miRNA进行了功能分析。主要结果如下：(1)以超高速离心的方法从猪脐带血中分离得到含量较丰富的exosome。通过AFM在纳米水平观察到猪脐带动静脉血exosome的大小符合正态分布,脐静脉血exosome平均宽度在120 nm左右,高度在17 nm左右,脐动脉血exosome平均宽度在130nm,高度在20nm,与前人报道的人唾液和猪乳汁中exosome的大小相近。(2)通过建库测序,正常猪脐动脉血(ND)和静脉血(NJ)以及IUGR猪脐动脉血(ID)和静脉血(IJ)exosome small RNA文库有效序列分别占到了总reads数的83.3%、81.9%、67.57%和62.74%。这些有效序列的长度大多在20～24nt之间,这些读数的长度是典型的Dicer酶加工产物长度,符合miRNA的基本结构特征。(3)生物信息学分析表明,在4个猪脐带血exosome small RNA文库中一共检测到554种pre-miRNAs和636种成熟miRNAs。其中,在4个文库鉴定到的保守miRNAs成熟体和前体分别有292个和260个。(4)每个文库中表达量前10的miRNAs占总量的60%以上。对Top10的miRNAs功能分析发现,脐静脉血中高表达的miRNAs主要参与红细胞生成、血管生成和血管疾病；脐动脉血还参与血管发育、免疫以及细胞因子应答等多个过程。(5)不同文库间两两比较表明,NJ与ND共有122个差异基因p0.001),其中60个在NJ中高表达,62个在ND中高表达；NJ与IJ共有116个差异基因p0.001),其中89个在NJ中高表达,27个在IJ中高表达;ND与ID共有226个差异基因p0.001),其中127个在ND中高表达,99个在ID中高表达。(6)筛选差异miRNAs进行功能富集分析,结果显示NJ与ND比较,13个上调基因主要富集在细胞生长、血管形成以及胚胎发育中等通路,7个下调基因主要富集对低氧环境的应答、调控细胞的凋亡以及信号转导以及对免疫应答通路；NJ与IJ比较,16个上调基因主要富集在转录调控活性、细胞增殖、生长通路,5个下调基因主要富集在细胞形态发生、GTP酶调节活性通路；ND与ID比较,16个上调基因主要富集在细胞死亡、凋亡、p53信号通路,5个下调基因主要富集在负调控细胞增殖、细胞程序性死亡以及MAPK信号通路中。表明脐带动静脉血之间存在功能差异,并推测IUGR猪脐带血exosome中miRNAs的表达差异与IUGR猪表型的形成有一定的关系。(7)对4个文库中差异表达的miRNAs聚类分析表明母体子宫内环境通过脐带血对IUGR猪的影响小于胎儿自身发育功能障碍。对IUGR猪和正常猪脐带血exosome中主要差异miRNAs功能分析发现,促进氧气运输和调节的miRNAs (miR-210、miR-424-3p、miR-27、miR-26a、miR-24、miR-181a、miR-23b、miR-26b、 miR-130b、miR-107)在IJ中表达下调、抑制氧气运输的miRNAs (miR-223、 miR-24、miR-138)在IJ中表达上调；促进血管生成的miRNAs (miR-130a、 miR-200c、miR-150、miR-17～92、miR-126、miR-378、miR-221、 miR-93、 miR-34a)在IJ和ID中表达下调,抑制血管生成的niRNAs (miR-16、miR-34a、miR-222)在IJ和ID中表达上调；促进免疫系统发育的miRNAs (miR-181a、miR-150、 miR-155)在IJ和ID中表达下调,而抑制免疫系统发育的miRNA (miR-146a)在IJ和ID中表达上调；促进代谢相关的niRNAs (miR-223、miR-210、let-7)在ID中表达上调,相反,抑制这个过程的miRNAs (miR-143、miR-199a-5p)在ID中表达上调。上述生理过程都是胚胎健康发育的必要条件,说明脐带血中的miRNAs参与了胚胎氧气传输、血管形成、免疫系统发育和能量代谢方面的调控,这些通路异常可能是导致IUGR猪形成的重要原因,IUGR的形成受到了宫内胚胎发育过程中脐带动静脉血exosome中miRNAs的调控。上述研究结果为深入研究脐带血在胚胎系统发育过程中的重要功能以及IUGR猪的形成机理提供了基础数据,证明可以将猪作为人类发育医学和血液疾病研究的模式生物。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

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本文编号：1322018