猪戊型肝炎病毒抗体阻断ELISA检测方法的建立与应用

发布时间：2017-12-24 16:08

  本文关键词：猪戊型肝炎病毒抗体阻断ELISA检测方法的建立与应用　出处：《西北农林科技大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一种人畜共患疾病,戊型肝炎病毒(HE virus,HEV)为其病原。猪是HEV主要的自然储存宿主,因此,对猪群中HEV感染的检测对于防控人HE的发生非常必要。目前,RT-PCR和ELISA是诊断该病的最常用方法,但是RT-PCR技术复杂、成本高,容易污染。而ELISA方法,一方面临床上大多使用针对人血清中HEV抗体检测的商品化ELISA试剂盒检测猪血清,其特异性较差;另一方面以基因3型或4型猪HEV的ORF2和ORF3蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法,由于蛋白的纯化要求高,易产生假阳性。因此,有必要建立一种敏感性和特异性高的猪HEV抗体检测方法,从而能够准确、快速了解猪HEV在猪群中的感染情况,进而制定相关HEV跨种传播的阻断技术。本课题用实验室保存的sORF2-C质粒通过原核表达后,制备了基因4型猪HEV的ORF2蛋白sORF2-C作为包被抗原,制备和HRP标记的抗sORF2-C蛋白的单抗HRP-1E4作为阻断抗体,建立了猪HEV特异性抗体的阻断ELISA检测方法,其结果如下:1.猪HEV ORF2重组蛋白sORF2-C的原核表达与纯化将实验室前期构建的包含编码猪HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸基因的重组质粒,转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS,37℃,IPTG诱导表达,然后镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析,结果发现s ORF2-C蛋白成功表达,并得到预期大小40 ku蛋白,浓度为7.0μg/μL。2.单克隆抗体的制备,纯化与标记以纯化的sORF2-C蛋白为免疫原,利用传统的杂交瘤细胞技术成功制备了抗sORF2-C蛋白的三株单抗1E4,2C7和2G9,亲和层析纯化后,浓度分别为1.86μg/μL,1.39μg/μL和1.89μg/μL。然后用HRP对纯化的单抗进行标记,直接ELISA方法测定三株标记株单抗的效价为1:100-1:1000。3.猪HEV抗体阻断ELISA检测方法的建立首先利用猪HEV阳性血清阻断3株标记单抗与sORF2-C蛋白的免疫反应发现,HRP-1E4的阻断率最高(60%左右),故选取该单抗为建立阻断ELISA方法的阻断抗体。然后通过棋盘滴定法确定了阻断ELISA的最佳反应条件,其中抗原浓度为20μg/mL(100μL/孔)、HRP-1E4稀释比例为1:1000、检测猪血清的稀释度为1:20;同时利用已知的230份猪HEV阴性血清,确定了该方法的Cut-off值为16.9%。4.阻断ELISA方法的评价敏感性评价:利用CHN-SD-sHEV分离株攻毒猪后不同天数的45份血清,分别用间接ELISA与阻断ELISA检测。结果显示,在攻毒后28天,两种方法均在血清中检测到抗猪HEV抗体;利用HEV抗体检测的商品化ELISA试剂盒以及阻断ELISA同时检测56份猪HEV阳性血清,两种方法检测均为阳性。上述结果表明,建立的阻断ELSIA敏感性与间接ELISA以及人血清HEV抗体检测的商品化ELISA试剂盒相同。特异性评价:利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV),和猪圆环病毒病(PCV)的三种抗病毒血清来评价阻断ELISA的特异性。结果显示,PRRSV,CSFV和PCV抗血清的阻断率远远低于猪HEV阳性血清的阻断率,因此本方法特异性高。重复性评价:阻断ELISA的板内、板间的重复性分析发现,板内和板间试验PI值的变异系数(CV值)均小于10%,证明本方法的重复性好。与间接ELISA,Western blot和商品化ELISA试剂盒一致性评价:2542份临床血清样品分别用阻断ELISA和间接ELISA方法检测,其结果一致性为93.23%;选取其中150份血清样品,分别用Western blot和商业ELISA试剂盒检测,结果发现阻断ELISA与Western blot和商业ELISA试剂盒的一致性均在90%以上。生物统计软件分析,其Kappa值均大于0.45,说明与其他方法一致性高。综上所述,本课题建立了一种快速、准确的检测猪HEV抗体的阻断ELISA方法;与间接ELISA、Western blot以及商业化ELISA试剂盒具有很高的一致性,可以用于猪群中猪HEV感染的血清学调查。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

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