miR-122在苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡过程中的作用

发布时间：2017-12-29 21:08

  本文关键词：miR-122在苦马豆素诱导山羊胎盘滋养层细胞凋亡过程中的作用　出处：《西北农林科技大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：microRNA(miRNA)是一种非编码的小RNA,长19~23个核苷酸,可以在转录后水平通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(untranslated region,UTR)结合而发挥广泛的生物学调节作用。苦马豆素(swainsonine,SW)为一种生物碱,是造成动物疯草病的主要毒素。SW可通过线粒体途径诱导山羊胎盘滋养层细胞(goat placental trophoblast cells,GTC)凋亡,但是SW诱导GTC凋亡的过程中是否有miRNA参与调控,miRNA在SW诱导GTC凋亡的过程中又有怎样的作用尚需进一步探究。本论文首先用SW诱导GTC凋亡,提取细胞总RNA进行miRNA测序,然后对测序结果进行生物信息学分析,筛选差异表达较大的miRNA,研究其对SW诱导GTC凋亡的作用。研究取得如下结果。1.分别用0.8μg/mL、1.6μg/mL、2.4μg/mL、3.2μg/mL SW处理GTC 24 h,MTT法检测细胞活性的变化。结果显示,不同浓度SW处理24 h后GTC的存活率分别为74.8%、61.8%、39.1%和25.2%;排除存活率过高和过低的0.8μg/mL与3.2μg/mL浓度,选用1.6μg/mL和2.4μg/mL的SW处理GTC 24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,发现细胞凋亡率分别为35.46%和78%,表明2.4μg/mL的SW处理后GTC凋亡率更高;用2.4μg/mL的SW分别处理GTC 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h,AO/EB染色,荧光显微镜下观察发现,SW处理24 h后的细胞开始出现不同程度的凋亡。因此,决定用2.4μg/mL的SW处理GTC 24 h后进行microRNA测序。2.microRNA测序后,用去除污染的clean reads进行后续数据的分析,统计结果表明,miRNA的长度主要分布在22nt,说明样品质量合格。分析SW处理前后GTC miRNA表达谱的变化,共筛选出25个差异表达显著的miRNA(fold change2,p0.05,表达量大于0.1),其中上调的miRNA有16个,下调的miRNA有9个。再根据表达量大于1的原则从25个差异表达显著的miRNA中选出3个上调的miRNA,4个下调的miRNA,用real-time PCR检验其表达量的变化,其变化趋势与miRNA测序结果一致,选取其中与凋亡相关的miR-122进行深入研究。使用Mireap、Miranda和TargetScan三个软件对25个差异表达显著的miRNA进行靶基因预测,取预测得到的交集作为miRNA靶基因预测的结果,共得到4777个靶基因。对预测到的靶基因进行GO和KEGG注释和聚类分析,得到51条富集显著(p0.05)的KEGG通路。3.根据生物信息学分析结果,筛选差异表达显著且与凋亡相关的miR-122作为研究对象,研究其在SW诱导GTC凋亡过程中的调控作用。将miR-122 mimics或inhibitors及其相对应的control分别转染GTC,再用SW处理细胞,检测细胞活性、caspase-3活性以及细胞凋亡率。发现过表达miR-122导致GTC的细胞活性降低、caspase-3的活性增加,并促进SW诱导的GTC凋亡;抑制miR-122表达则增加GTC的活性、降低caspase-3的活性,并抑制SW诱导的GTC凋亡,表明miR-122在SW诱导GTC凋亡的过程中起到促进凋亡的作用。根据生物信息学分析结果,筛选与细胞凋亡相关的靶基因,用双荧光素酶和western blotting验证miR-122的靶基因。将靶基因的3′UTR克隆至双荧光素酶质粒psiCHECK-2,构建含靶基因3′UTR结合位点的重组双荧光素酶质粒。将miR-122mimics与重组双荧光素酶质粒共转染至GTC,检测miR-122与靶基因3′UTR的结合活性,发现过表达miR-122后含有Bcl-w 3′UTR重组质粒的细胞双荧光素酶活性显著降低。将miR-122 mimics或mimics control转染至GTC,western blotting检测Bcl-w蛋白水平,发现过表达miR-122后Bcl-w的蛋白表达量显著降低,以上结果表明Bcl-w是miR-122的靶基因。本研究发现SW处理会引起GTCmiRNA表达谱发生变化且miR-122的表达量显著下调,证明了miR-122可以促进SW诱导的GTC凋亡并验证了miR-122的靶基因为Bcl-w,阐明了miR-122在W诱导的GTC凋亡过程中的作用,为进一步研究SW的致病机理提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.3

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本文编号：1351874