鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条检测方法的建立和应用

发布时间：2018-01-25 01:46

本文关键词： 鸭瘟病毒 gB gC基因序列分析 gB蛋白单克隆抗体胶体金检测试纸条　出处：《山东农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鸭瘟是由鸭瘟病毒引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。免疫预防是控制鸭瘟的重要措施,但近年来不断出现鸭瘟疫苗免疫效果不佳的情况,鸭瘟病毒是否发生变异,找出其中的原因至关重要。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,目前已建立了PCR、ELISA、间接免疫荧光技术、微量中和试验等检测鸭瘟的方法,但是这几种检测方法均需特殊的仪器设备,且耗时长,不适于在基层推广应用。因此,建立一种更加快速、灵敏的病毒检测方法迫在眉睫。胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的集胶体金标记技术、蛋白层析技术于一体的新型快速免疫检测技术。该技术操作简便、耗时短,不需要特殊的仪器设备,特别适合在基层推广应用。单克隆抗体具有性质均一稳定、特异性高等特点,可以作为病毒诊断方法的一个良好的工具。作为鸭瘟病毒的高度保守性蛋白之一,gB蛋白的免疫原性良好,高度的特异性和保守性决定了该蛋白能够为建立新的检测方法提供良好的材料。本研究通过对近几年来从各地采集的鸭瘟病料,扩增DPV主要基因gB gC基因并进行测序比对分析,从分子水平上研究鸭瘟病毒变异情况。制备针对鸭瘟病毒gB蛋白的单克隆抗体,并利用制备的单抗,建立了胶体金试纸条检测方法。本研究设计鸭瘟病毒gB gC基因的特异性引物,将近几年来各地送检疑似鸭瘟病料处理后,采用鸭胚尿囊膜接种法分离鸭瘟病毒,提取病毒DNA作为模板。PCR扩增目的基因,连接于载体pMD-18T上,将PCR鉴定为阳性的菌液测序,与NCBI上已发表的鸭瘟强毒株2085(序列号:JF999965)及鸭瘟弱毒疫苗株VAC(序列号:EU082088)序列进行比对,同时比对不同毒株之间的同源性。结果显示,测序的9株鸭瘟病毒的同源性在99%~100%之间,表明鸭瘟病毒主要基因未发生变异。利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经western blot鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:103、1:103、1:105、1:103。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blot结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。在获得DPV-gB特异性单克隆抗体的基础上,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的H6F6单抗作为标记抗体(标记的最适pH值为8.0~8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释),将纯化的A8D7单抗(浓度为2倍原液稀释)和羊抗鼠IgG(浓度为10倍稀释)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。检测结果显示:该试纸条能够特异地检测鸭瘟病毒,与DRV、EDS-76V、AIV-H9N2、TMUV均无交叉反应;阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6%。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,便于DPV的快速诊断和检测。
[Abstract]:This paper presents a new rapid and sensitive method for detecting duck plague , which is one of the important measures to control duck plague . The results showed that the purified A8D7 monoclonal antibody was used as antigen , and then it was cloned into prokaryotic expression vector pET - 28a . The results showed that 4 strains of duck plague virus could be used as the antigen , and then it was cloned into prokaryotic expression vector pET - 28a .

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

【参考文献】