丝氨酸蛋白酶对猪流行性腹泻病毒S蛋白的作用及其对病毒繁殖的影响

发布时间：2018-01-26 19:38

本文关键词： 猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白 Ⅱ型丝氨酸蛋白酶(TTSP) 病毒复制　出处：《东北农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的,以各年龄猪呕吐、腹泻、脱水为特征的一种急性、高度接触性肠道传染病。PED的暴发及流行给我国和世界养猪国家造成了巨大的经济损失,现已成为仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来,有报道称即使疫苗免疫过的猪群仍可感染PEDV,疫苗免疫效果的下降可能是由于PEDV流行毒株的变异导致的。因此探索PEDV感染的发生、发展机制,建立有效的分离培养方法,研发特效的新型药物和高效的疫苗制品是各国学者关注并亟待解决的问题。而在实践中,PEDV新流行毒株的分离培养难度大,细胞繁殖滴度低是制约对该病毒深入研究的重要障碍。近年来,有报道发现一些宿主蛋白酶,其中包括Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TTSP)家族中的几个成员,具有类似胰酶的催化活性,可以裂解活化流感病毒及一些冠状病毒囊膜蛋白,在没有胰酶的条件下促进病毒侵入宿主细胞进行繁殖复制,但是对于同是需要胰酶培养的PEDV繁殖影响的研究却并不深入。本研究选取TTSP家族中跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)、呼吸道胰酶样蛋白酶(human airway trypsin-like protease,HAT)、鳞癌细胞差异表达蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1,DESC1)和镶嵌式长型丝氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form,MSPL)进行研究,分析其对PEDV繁殖的影响,并进一步深入机理探究其对S蛋白的作用。由于PEDV体外连续传代可能会失去对胰酶的依赖性,因此本研究首先确认实验室保存的PEDV分离株LJB/03低代次(P23)和高代次(P146)细胞培养毒对胰酶的依赖性。通过接毒病变情况,结合荧光定量PCR及S蛋白序列比对分析,结果表明LJB/03 P23具有胰酶依赖性,而LJB/03 P146在添加胰酶和不添加胰酶的条件下繁毒效果差异不大,具有胰酶不完全依赖性。通过PEDV S蛋白氨基酸序列比对发现,LJB/03 P146部分突变和缺失的氨基酸残基与其他弱毒株突变位点一致,说明LJB/03 P146经过连续传代可能有弱化的趋势。为了探究TTSPs对PEDV繁殖的影响,分别选取PEDV LJB/03 P23和P146作为研究对象,分析TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL对依赖胰酶和不完全依赖胰酶的PEDV毒株在Vero细胞上复制的作用。结果表明,TMPRSS2和MSPL有效促进具有胰酶依赖性的PEDV LJB/03 P23毒株在不添加胰酶的Vero细胞上的繁殖,并提高病毒滴度,其中MSPL促进效果最为显著,甚至优于3μg/mL胰酶的作用,HAT和DESC1则没有显著的促进效果。而不完全依赖胰酶的LJB/03 P146对TTSPs和胰酶均不敏感。为评价TTSPs是否有助于PEDV流行毒株的体外分离培养,将感染PEDV的仔猪小肠组织进行处理,分别接种于瞬时表达TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL的Vero细胞,并与胰酶组进行对比。结果发现PEDV分离毒株在表达TMPRSS2和MSPL的Vero细胞上可以稳定传代,并且繁殖效果要优于HAT、DESC1和添加胰酶组。通过TTSPs对PEDV在Vero细胞上繁殖促进作用的初步探索,结果显示PEDV在Vero细胞上繁殖对TMPRSS2和MSPL具有计量依赖性,而HAT和DESC1对PEDV无激活活性。利用哺乳动物双杂交系统结合双荧光素酶检测发现,TMPRSS2和MSPL有效促进感染LJB/03 P23的Vero细胞膜融合,其中MSPL优于1μg/m L胰酶作用效果;而TTSPs对LJB/03 P146的促细胞膜融合效果并不显著。为了研究TTSPs是否有助于PEDV病毒粒子侵入,并从反面验证TTSPs对PEDV的复制有促进作用,采用TTSP的抑制剂AEBSF-HCl与依赖胰酶特性的LJB/03 P23进行研究。结果显示,AEBSF-HCl具有显著抑制TTSPs活性,从而使PEDV在表达TTSPs的Vero细胞上的繁殖抑制效果呈剂量依赖性,病毒mRNA水平随抑制剂浓度增高而降低。为进一步验证TTSPs与PEDV LJB/03 P23、P146的相互作用,利用激光共聚焦试验分析二者在细胞的定位情况。结果显示,LJB/03 P23、P146与TMPRSS2和MSPL产生良好的共定位效果,而与HAT和DESC1并未观察到共定位现象。为了深入探究TMPRSS2和MSPL促进PEDV在宿主细胞中复制的机理,分别构建了PEDV LJB/03亲本株和P146毒株的S蛋白真核表达质粒,研究TTSPs对PEDV依赖胰酶的亲本株和不完全依赖胰酶的适应细胞株S蛋白的作用。胰酶对S蛋白裂解性试验结果显示,与18μg/m L胰酶作用后的S蛋白于150 k Da左右均有一条特异性的裂解条带,且S蛋白的全长条带亮度明显减弱。该结果证实胰酶识别S蛋白的裂解位点在S2区的890位氨基酸,其裂解活性可以促进病毒与宿主细胞膜融合,利于病毒粒子的侵入。为了研究TTSPs对PEDV S蛋白的裂解作用,分别将TTSPs与S蛋白真核表达质粒进行共转染,结果显示TMPRSS2和MSPL均可以将PEDV亲本株和适应细胞株的S蛋白裂解,产生约35 k Da的裂解条带,而HAT和DESC1并未检测到对S蛋白的裂解。分析TMPRSS2和MSPL可能识别裂解S1区域,该区域氨基酸具有PEDV受体结合区及识别辅助糖受体的功能。与胰酶的裂解作用不同的是,TMPRSS2和MSPL对S蛋白的裂解可能暴露PEDV纤突蛋白与宿主细胞受体结合区,使病毒粒子更易于与细胞受体结合,促进病毒侵入从而增强PEDV感染细胞的能力。通过激光共聚焦技术证实了TMPRSS2和MSPL可以与S蛋白之间发生相互作用。利用PEDV S蛋白包装的假病毒模拟病毒粒子,进一步验证TTSPs在病毒侵入阶段是否有促进作用。结果显示TMPRSS2和MSPL有效促进PEDV亲本株S蛋白包装的假病毒侵入细胞,而这种激活作用很可能与丝氨酸蛋白酶对S蛋白的裂解活化作用有关。利用哺乳动物双杂交系统分析结果显示,TMPRSS2和MSPL不但激活亲本株的S蛋白,还对不完全依赖胰酶的适应细胞株的S蛋白具有激活效果,促进细胞膜的融合。通过对仔猪小肠组织TTSPs表达水平的检测,结果显示四种TTSPs均有表达;而在感染PEDV的小肠组织上,TTSPs相对表达水平均略有增高,这可能是PEDV为了在体内更好的感染和复制,诱导机体上调表达TTSPs的结果。综上所述,本研究筛选出TMPRSS2和MSPL可有效促进有胰酶依赖性的PEDV在不添加胰酶的Vero细胞上的复制,并进一步证实TMPRSS2和MSPL对S蛋白具有裂解催化活性,可以激活病毒粒子侵入宿主细胞、促进膜融合从而利于病毒的繁殖复制。本研究揭示了TTSPs与PEDV S蛋白互作的分子机制及其对PEDV复制的影响,为提高病毒繁殖滴度、扩大病毒产量、提高流行毒株体外培养适应性提供新的思路。
[Abstract]:Porcine epidemic diarrhea ( PED ) is caused by porcine epidemic diarrhea virus ( PEDV ) . It is an acute and highly contagious intestinal infectious disease characterized by vomiting , diarrhea and dehydration in pigs . In order to study the effect of PEDV isolate LJB / 03 P146 on Vero cells , the results showed that the PEDV isolates could be stably passaged on Vero cells without pancreatin , and the effect of LJB / 03 P146 on Vero cells was observed . The results showed that the cleavage activity of the S - protein could be enhanced by the cleavage of PEDV - S protein . The results showed that the cleavage activity of the S - protein could promote the fusion of PEDV - dependent strains and the host cell membrane .

【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651

【参考文献】