黄芩苷对免疫应激仔猪外周血单核细胞NF-κB及NLRP3信号通路的影响

发布时间：2018-01-27 09:48

  本文关键词： 黄芩苷 脂多糖 NF-κB NLRP3 仔猪外周血单核细胞　出处：《武汉轻工大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪场养殖中,断奶仔猪易受细菌及病原体感染,引发免疫应激。免疫应激所引起的仔猪过度炎症反应,严重影响养猪生产。脂多糖(LPS)是具有代表的一种免疫诱导剂,常被用来构建动物免疫应激模型。本课题组前期的工作中已经成功的使用LPS建立了仔猪的免疫应激炎症模型。本论文通过研究不同浓度的黄芩苷对仔猪外周血单核细胞免疫应激的影响,探索NF-κB及NLRP3信号通路在黄芩苷缓解仔猪外周血单核细胞免疫应激性炎症的作用。1.黄芩苷对脂多糖诱导仔猪外周血单核细胞NF-κB信号通路的影响建立仔猪外周血单核细胞免疫应激性疾病体外模型。方法:采取仔猪前腔静脉抗凝血液,依照细胞分离方法,分离得到仔猪外周血单核细胞。分别设置空白对照组、内毒素(LPS)造模组、黄芩苷处理组(12.5、25、50和100μg/m L)。药物组加入相应浓度黄芩苷预处理1h后加入终浓度为1μg/m L的LPS诱导,继续培养3、16和20h,采用ELISA方法测定LPS诱导3h后单核细胞核蛋白和胞浆蛋白NF-κB p65比值、3h后细胞培养上清液中TNF-α的含量以及16h和20h后细胞培养上清液中IL-6的含量;采用RT-PCR方法,测定仔猪外周血单核细胞裂解液中(LPS诱导刺激3h后)TNF-α和IL-6的m RNA表达量。结果:①脂多糖诱导3h后,仔猪外周血单核细胞核蛋白与胞浆蛋白NF-κB p65比值极显著提高(P0.01),黄芩苷浓度分别在12.5μg/m L和100μg/m L时能够显著(P0.05)或极显著(P0.01)地抑制LPS诱导的NF-κB p65蛋白的核转移;其它浓度的黄芩苷均对NF-κB p65蛋白的核转移有一定抑制作用,但未达显著水平。②脂多糖诱导3h后,仔猪外周血单核细胞上清液中TNF-α极显著增加(P0.01)。黄芩苷浓度在12.5μg/m L时即能显著地(P0.05)抑制TNF-α的分泌,浓度在25、50和100μg/m L时均能够极显著(P0.01)的减少TNF-α的释放。③脂多糖诱导16h和20h后,仔猪外周血单核细胞上清液中IL-6含量均极显著升高(P0.01)。黄芩苷浓度在12.5μg/m L时显著地(P0.05)抑制16h和20h后细胞上清液中IL-6的分泌;同时黄芩苷浓度在25、50和100μg/ml时均能够极显著地(p0.01)降低lps刺激16h和20h后细胞上清液中il-6的含量。④脂多糖诱导3h后,单核细胞裂解液中tnf-α和il-6mrna表达量均极显著上调(p0.01)。黄芩苷浓度在25、50和100μg/ml时均能够极显著地(p0.01)抑制lps诱导的tnf-αmrna表达上调,浓度在12.5μg/ml时也能够显著地(p0.05)下调tnf-αmrna表达。黄芩苷浓度在50、100μg/ml时极显著地(p0.01)抑制il-6mrna表达,浓度在12.5、25μg/ml时能够显著地(p0.05)抑制il-6mrna的表达。2.黄芩苷对脂多糖诱导仔猪外周血单核细胞nlrp3信号通路的影响建立仔猪外周血单核细胞免疫应激性疾病体外模型。方法:将分离培养后所得的仔猪外周血单核细胞分别设为空白对照组、lps造模组、黄芩苷处理组(12.5、25、50和100μg/ml),药物组加入相应浓度黄芩苷预处理1h后加入终浓度为1μg/ml的lps诱导,继续培养3、16和20h。采用荧光显微镜观察lps诱导3h后细胞内活性氧(ros)含量;采用elisa法检测lps诱导16h和20h后细胞培养上清液中的il-1β和il-18的蛋白表达量;采用rt-pcr法检测lps诱导3h后仔猪外周血单核细胞裂解液中nlrp3、asc、caspase-1、il-1β及il-18的mrna表达量;采用荧光显微镜观察lps诱导3h和6h后单核细胞的中晚期凋亡情况(apoptosis);采用westernblot法检测lps诱导10h后仔猪外周血单核裂解液中cleavedcaspase-1p20蛋白表达量。结果:①脂多糖诱导3h后,仔猪外周血单核细胞内ros表达量极显著的增加(p0.01)。黄芩苷浓度在12.5、25、50和100μg/ml时均能够极显著地(p0.01)抑制细胞内ros的释放。②脂多糖诱导16h和20h后,仔猪外周血单核细胞上清液中的il-1β和il-18的蛋白表达量均极显著地(p0.01)增加。黄芩苷浓度在50μg/ml时能够显著地(p0.05)抑制16h和20h后细胞上清液中il-1β和il-18的蛋白分泌,浓度在100μg/ml能够极显著地(p0.01)抑制16h和20h后单核细胞上清液中il-1β和il-18的分泌。③脂多糖诱导3h后,仔猪外周血单核细胞nlrp3、il-1β和il-18的mrna表达均极显著上调(p0.01),但asc及caspase-1的mrna表达量差异不显著。25、50和100μg/ml的黄芩苷均能够极显著地(p0.01)下调nlrp3mrna的表达量,黄芩苷浓度在12.5μg/m L时能够显著地(P0.05)抑制NLRP3 m RNA的表达量。黄芩苷浓度在50和100μg/m L时显著地(P0.05)抑制IL-1βm RNA的表达效果,其余浓度可在一定程度上降低IL-1βm RNA的表达量,但是未达显著差异。黄芩苷浓度在50和100μg/m L时可极显著地(P0.01)抑制IL-18 m RNA的表达,浓度25μg/m L时显著地(P0.05)下调IL-18 m RNA的表达量。④脂多糖诱导3h和6h后,中晚期凋亡的仔猪外周血单核细胞荧光强度值极显著的增加(P0.01)。黄芩苷浓度在12.5、25、50和100μg/m L时均能够极显著地(P0.01)降低中晚期凋亡细胞的数量及密度,缓解细胞凋亡的产生。⑤脂多糖诱导10h后,仔猪外周血单核细胞中Cleaved Caspase-1 p20的蛋白表达量极显著增加(P0.01)。黄芩苷浓度在25、50和100μg/m L时均能够极显著地(P0.01)抑制Cleaved Caspase-1 p20蛋白表达。以上结果表明,黄芩苷能缓解由脂多糖诱导引起的仔猪外周血单核细胞的炎症反应,其作用与抑制NF-κB信号通路和NLRP3信号通路有关。
[Abstract]:The effect of baicalin on the immune stress of peripheral blood mononuclear cells in piglets was established by studying the effects of baicalin on the immune stress of peripheral blood mononuclear cells in piglets . The levels of TNF - 伪 and IL - 6 in peripheral blood mononuclear cells of piglets were significantly increased ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

【参考文献】

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本文编号：1468180