猪血凝性脑脊髓炎病毒双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制与应用
本文关键词： 猪血凝性脑脊髓炎 N蛋白 单克隆抗体 双抗夹心ELISA 试剂盒 出处：《吉林大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：猪血凝性脑脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染猪后引起的一种以呕吐、衰竭和显著神经症状为临床特征的急性、高度接触性传染病。成年猪多呈隐性感染。但3周龄以内的仔猪尤为易感,一旦发病,死亡率最高可达100%。目前针对PHE的诊断方法有多种,但有的需要大型仪器设备、有的容易出现假阳性或敏感性不够,使得这些方法不利于在临床上对疫情做出快速准确的诊断,在疫情紧急时,甚至阻碍了该病防治工作的快速进行。所以,本实验通过制备PHEV N蛋白单克隆抗体及其多克隆抗体,成功构建并组装双抗夹心ELISA抗原诊断试剂盒并初步用于临床检测,旨在帮助基层养殖户在疫情发生或流行时做出准确及时的判定。具体研究内容如下:1.PHEV N蛋白基因大肠杆菌表达载体的构建及N蛋白的纯化根据N蛋白基因序列,使用Primer5.0设计N蛋白表达引物。将该基因片段克隆至原核表达载体p ET-28a,成功构建重组表达载体p ET-28a-N。再将重组载体转化至大肠杆菌(BL21)中,经过IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,获得大小为55KDa的重组蛋白N。用Ni-NTA亲和层析进行重组蛋白的纯化后测定蛋白浓度,获得重组N蛋白浓度为:1659.3ug/m L、1139.1ug/m L和726.8ug/m L。2.PHEV单克隆抗体的制备将纯化的重组N蛋白,对6~8周龄健康Balb/c小鼠背部皮下多点注射,进行免疫。四次免疫之后,ELISA检测小鼠血清抗体效价,P/N2.1时,取小鼠脾细胞与培养好的SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方法对融合后的细胞进行筛选。获得四株可稳定分泌抗PHEV的单克隆抗体,并进行亚类鉴定,分别是2H2(Ig G1)、2A1(Ig G1)、1E2(Ig G2a)、4D4(Ig G1);四株效价均在1:12800~1:51200之间;经Western blot分析,编号2A1可识别非结构蛋白N;经间接ELISA和间接免疫荧光鉴定,4株单抗均能与PHEV特异性结合。3.PHEV抗体阴性及阳性对照血清、兔抗PHEV多克隆抗体的制备将PHEV-67N标准毒株对健康家兔进行人工皮下注射,制备阳性对照血清及兔抗PHEV多克隆抗体。当ELISA检测血清效价达到105以上,无菌采血并分离血清作为阳性对照血清,过滤除菌之后存于-20℃中。阴性对照血清采自健康6月龄家兔,采血并分离血清后,经PCR及ELISA检测血清PHEV抗体均为阴性。对两份血清分别进行PEDV、TGEV、PCV2和PRV的ELISA检测,结果均呈阴性。4.PHEV抗原捕获ELISA检测方法的建立、试剂盒的组装及质量检测用制备的兔抗PHEV多克隆抗体包被酶标板,以抗N蛋白单克隆抗体作为检测抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法,并对其反应条件进行优化:多抗最佳稀释倍数为8000倍;单克隆抗体最佳工作浓度为0.5μg/m L;最佳封闭液是5%BSA,时间为2h;捕获抗体(兔多抗)最佳包被时间为4℃过夜处理、检测抗体(单抗)在37℃条件下孵育1h时效果最佳;显色时间最佳为15min。经过特异性、灵敏度试验,结果显示该方法特异性良好,无交叉反应;能够检测出的最低PHEV浓度为63.12ng/m L。根据建立的检测方法,完成了对试剂盒的组装,并对其质量进行了评估:试剂盒批内变异系数(CV%)介于4.8%~9.6%之间,批间变异系数(CV%)介于3.2%~8.9%之间,均小于10%,具有良好的重复性;通过37℃加速老化试验,显示试剂盒在4℃温度下能够密封保存6个月左右;应用组装的ELISA试剂盒与实验室建立的RT-PCR检测方法分别对人工感染的小鼠和对吉林省范围内采集的200份疑似病猪进行检测,结果显示两种方法阳性检出总符合率都在90%以上。综上所述,本实验成功建立双抗夹心ELISA检测方法,完成了对ELISA检测试剂盒的组装与质量评估。经检测,该试剂盒在灵敏度、重复性及稳定性上均达到要求,为后期试剂盒的转化和市场化应用奠定了坚实的基础。
[Abstract]:The recombinant expression vector pET - 28a - N was cloned into E . coli BL21 . After four immunization , the recombinant expression vector pET - 28a - N was successfully constructed . The positive control serum and the rabbit anti - PHEV polyclonal antibody were detected by indirect ELISA and indirect immunofluorescence assay . In conclusion , the results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % . The results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28
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，本文编号：1472214
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