靶向H、N基因siRNA抑制Vero细胞中CDV的增殖研究

发布时间：2018-02-16 03:26

  本文关键词： RNAi CDV N基因 H基因　出处：《吉林大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：犬瘟热(canine distemper,CD),是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)感染犬科等动物引起的一种高接触性的烈性传染病。该病传染性强,死亡率高,范围遍布全世界,给动物保护和经济养犬业造成了巨大的损失。目前该病以预防为主,尚无有效治疗手段。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象,是古老的生物体内的自我防御机制。RNA干扰技术现已经广泛应用于病毒病、治疗和靶点选择、保护宿主免受病毒感染、病毒基因组转录调控、表达目的蛋白、抑制抗原表达,揭示病毒与宿主相互作用的影响。CDV核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)是包裹在RNA外的一层螺旋状蛋白,是CDV基因中最保守的区域。N蛋白基因组中存在9个碱基的T细胞表达基因。CDV血凝素蛋白(hemagglutinin,H)是存在于病毒囊膜表面的蛋白,主要功能是介导病毒粘附宿主细胞膜,在病毒入侵宿主细胞过程中起着重要作用。本实验以CDV的H基因和N基因作为靶基因,进行si RNA抑制病毒增殖的研究,为CDV的防控和治疗提供新思路及方法。本实验研究CDV在Vero细胞中的增殖特性。采用五种检测方法对Vero细胞接种CDV后不同时间段的增殖情况进行了检测。免疫荧光(IFA)结果显示,感染CDV 12h后观察到少量细胞出现绿色荧光,48h后大多数细胞出现绿色荧光;细胞病变(CPE)分析发现,感染CDV 36h后细胞开始出现病变,48h后大多数细胞出现明显病变;半数细胞感染量(TCID50)结果显示,感染CDV在36h-48h之间,病毒滴度值明显增高,表明病毒进入指数增殖期,48h后增殖速度减缓;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印记(western blot)检测结果发现CDV增殖趋势与TCID50结果一致。综合上述结果表明,CDV感染细胞12h后可以检测到子代病毒;36h后进入指数增殖期;48h后病毒增殖速度减缓;在72h病毒滴度达到峰值。针对CDV H基因和N基因设计并合成si RNA各三对,转染细胞后感染病毒。经过如下方法检测:IFA结果表明,转染细胞感染CDV 48h后,6个干扰组细胞出现的绿色荧光明显少于对照组;CPE结果表明,6个干扰组细胞病变比正常对照组少;TCID50结果表明:6个干扰组病毒感染滴度分别是对照组的1/293、1/11、1/29、1/83、1/302、1/90;Real-time PCR结果显示,6个干扰组的CDV基因拷贝数分别是对照组的12.96%、57.75%、23.47%、31.82%、12.82%、15.58%。western blot结果显示,干扰组病毒蛋白表达量少于对照组。以上结果表明,6对si RNAs均对CDV在vero细胞中的复制具有不同程度的抑制作用。其中H基因中以si H2效果最好,N基因中以si N1效果最好。针对RNAi技术中si RNA转染时机进行研究。分别设计如下实验组:A感染病毒前进行转染;B感染病毒后0-12h进行转染;C感染病毒12h后进行转染。通过五种检测方法检测CDV增殖情况。IFA结果表明,在接种病毒前进行转染的实验组几乎没有绿色荧光,而其他实验组大多数细胞产生荧光效果;CPE结果表明,在接种病毒前进行转染的实验组细胞病变比其他实验组少;TCID50结果表明,在接种病毒前进行转染的实验病毒滴度明显低于其他实验组;Real-time PCR结果与TCID50结果一致。western blot检测结果同样表明接种病毒前进行转染的实验组病毒蛋白表达量减少。以上结果表明,感染CDV前转染si RNA对病毒抑制效果最好,有效抑制时间为72-84h。该实验结果能为抗CDV感染提供参考依据;同时,也为CDV感染过程中病毒的基因功能分析提供新思路。
[Abstract]:CDV nuclear capsid protein ( CDV ) is one of the most conserved regions in Vero cells . The results showed that the expression of CDV in 6 interfering groups was significantly lower than that in the control group . The results showed that the expression of CDV gene was lower than that in the control group . The effective inhibition time is 72 - 84h . The experimental results can provide a reference for anti - CDV infection , meanwhile , it provides a new idea for gene function analysis of virus in the process of CDV infection .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：1514551