猪树突状细胞在猪链球菌2型感染致炎症风暴中的作用研究

发布时间：2018-02-26 14:08

本文关键词： 猪链球菌2型猪MoDC CD4+T细胞炎症风暴 Th亚型分化　出处：《华中农业大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪链球菌病是由猪链球菌(Streptocuccus suis,SS)引起的对世界许多国家养猪业造成极大危害的人畜共患病。在已知的35种猪链球菌血清型中,毒性最强,研究最多的为猪链球菌2型(Streptocuccus suis serotype 2,SS2)。我国有两次较大规模的2型猪链球菌病的爆发,分别发生在江苏省部分地区(1998)和四川省资阳地区(2005),不仅对养猪业造成巨大经济损失,还导致了数百人感染、数十人死亡。猪感染猪链球菌2型后在短时间内迅速出现脑膜炎、关节炎、肺炎等,严重的甚至死亡,表现出明显的炎症风暴症状。但目前对猪链球菌致病机理的研究多集中在脑膜脑炎的发生机制上,对猪链球菌侵入机体后如何导致炎症风暴,从而致死动物或人还不是十分清楚。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是呈递抗原能力最强的抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells,APCs)。DC受不同类型抗原刺激后分泌不同类型的细胞因子,调节机体的炎症反应、诱导CD4+T细胞向不同的方向定向分化,在非特异性免疫应答和特异性免疫应答中发挥重要作用。然而,猪的DC在猪链球菌感染后产生的炎症风暴中是否发挥重要作用、以及发挥何种作用还少见报道。为了研究DC在猪链球菌感染导致炎症风暴中的作用,本研究首先建立体外培养猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Monocyte-derived DCs,Mo DCs)的方法,依据树突状细胞共同特点,对目标细胞的形态、细胞膜表面标志、吞噬能力、刺激T淋巴细胞增殖能力进行检测,结果得到高质量的Mo DC,为后续研究奠定了基础。接下来用猪链球菌2型野生菌株SC19刺激Mo DC,检测Mo DC分泌的细胞因子种类,重点考察促炎因子、抑炎因子、IL-12等的水平,为评价Mo DC在炎症反应中的贡献及定向诱导何种Th亚型细胞分化提供依据。最后,将Mo DC和CD4+T细胞混合在一起,用SC19刺激细胞混合物,获得CD4+T细胞定向分化的结果,为阐明Mo DC在引发炎症风暴中的作用提供进一步的依据,主要研究内容及结果如下:(1)成功建立了体外培养猪外周血Mo DC的方法。采集猪前腔静脉的外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法,先分离到猪的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),再通过免疫磁珠分选法分离到高纯度的CD14+的单核细胞,将CD14+的单核细胞用含有猪GM-CSF和猪IL-4的RPMI-1640培养液培养,并进行细胞形态显微镜观察、细胞膜表面标志流式检测、吞噬中性红能力检测、刺激T淋巴细胞增殖能力的检测,结果表明通过3~5d后得到大量高纯度半悬浮的猪Mo DC。(2)用SC19刺激培养至5d的Mo DC,细胞流式表型分析显示Mo DC的CD1和CD172a表达下降,吞噬中性红的能力降低,刺激T淋巴细胞增殖能力增强,表明SC19可以刺激Mo DC的成熟,且Mo DC存在自发成熟的现象。受SC19刺激后,Mo DC分泌高水平IL-1β、IL-8、TNF-α、IFN-γ等促炎性细胞因子,分泌低水平IL-10、TGF-β抑炎性细胞因子,分泌很高水平的IL-12,其中IL-8和IL-12的分泌水平呈现明显的SC19剂量依赖性。Mo DC分泌高水平IL-12的结果提示SC19刺激Mo DC后会诱导CD4+T向Th1亚型分化。(3)为进一步验证SC19刺激Mo DC确实会诱导CD4+T向Th1亚型分化,将培养5d的Mo DC与新分离的CD4+T细胞混合,加入SC19刺激,17h后流式检测Th亚型,结果显示Th1亚型细胞数量上升比Th2亚型明显;蛋白质芯片检测混合细胞培养上清细胞因子,Th1效应性细胞因子IFN-γ明显增加;表明SC19刺激的Mo DC诱导CD4+T向Th1亚型分化。以上研究结果提示:Mo DC在猪链球菌感染引发炎症风暴中发挥重要作用,主要通过分泌高水平的促炎因子及IL-12、IL-12诱导分化出的Th1细胞及其分泌的细胞因子发挥作用。
[Abstract]:Streptocuccus cellulosum ( SS ) is the most poisonous animal in the world , which is caused by Streptocuccus cellulosum ( SS ) . Among the 35 kinds of swine streptococci which are known , the toxicity is the strongest , most of which is Streptocuccus cellulolytic 2 , 2 2 . In China , there are two large - scale outbreaks of type 2 swine streptococci , which occur in some parts of Jiangsu province ( 1998 ) and Ziyang area of Sichuan province ( 2005 ) . In order to study the role of DCs in the inflammatory response induced by S . S . infection , the results were as follows : ( 1 ) The peripheral blood mononuclear cells ( PBMCs ) were isolated from peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) of porcine peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) . The results suggested that the expression of IL - 1尾 , IL - 8 , TNF - 伪 , IFN - 纬 could stimulate the differentiation of CD4 + T to Th1 subtype after stimulated by SC19 . The results suggested that the expression of IL - 8 and IL - 12 induced CD4 + T to differentiate into Th1 subtype .

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

【参考文献】