乙型脑炎病毒诱导miR-15b的表达调控及功能研究

发布时间：2018-03-06 21:21

本文选题：微小RNA　切入点：转录调控　出处：《华中农业大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属病毒。它是一种危害严重的人兽共患病病原,感染人和动物后引起乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)。据统计,亚洲地区每年JE发病人数达35000-50000例左右,死亡10000例左右,而存活的患者中接近半数的人伴有永久的神经后遗症。同时,JE也是危害养猪业的重大疫病之一,主要引起怀孕母猪流产、死胎、产木乃伊胎,公猪睾丸炎。靶向中枢神经系统,并引发过度的神经炎症反应,是JEV导致人和动物发病、死亡的主要因素,但其分子机制仍待阐明。微小RNA(microRNA)是一类约22个核苷酸长的非编码RNA分子,通过与靶基因mRNA的3’UTR区域结合,抑制靶基因mRNA的翻译或降解mRNA,从而在转录后水平调控基因的表达。microRNA作为一种调控因子,广泛参与细胞增殖分化、癌症和细胞凋亡等重要生物学过程。近年来的研究发现,microRNA还能参与病毒感染及调控TLR和RIG-I介导的炎症反应。尽管如此,microRNA是否参与JEV感染仍不清楚。因此,本研究旨在以miR-15b为研究对象,探索JEV感染胶质细胞后介导miR-15b表达调控的分子机制及其生物学功能。具体内容如下:1.JEV感染上调miR-15b的表达在JEV感染的人星形胶质细胞(U251细胞)和小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)中,用荧光定量PCR的方法检测miR-15b的表达水平,发现miR-15b的表达显著上调,并呈时间和剂量依赖性。检测JEV感染的小鼠脑组织中miR-15b的水平,发现miR-15b的表达上调。结果表明JEV感染在体内和体外都能上调miR-15b的表达。2.c-Rel和CREB调控miR-15b的转录本研究发现在JEV感染细胞中,mi R-15b的初级转录本(pri-miR-15b)与成熟miR-15b的变化趋势一致,说明JEV在转录水平上调控miR-15b的表达。通过分析miR-15b启动子区域,我们发现启动子区域上含有转录因子c-Rel和CREB结合位点。为了确定c-Rel和CREB能与这些位点结合从而调控mi R-15b的转录,我们突变了启动子上的结合位点并构建到报告质粒上,启动子活性结果显示c-Rel和CREB能结合到miR-15b的启动子区域,调控JEV诱导的miR-15b的转录。此外,染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果表明c-Rel和CREB可以直接结合到miR-15b的启动子区域。为了进一步探究调控miR-15b表达的信号通路,我们利用信号通路抑制剂及siRNA处理细胞,结果显示ERK和NF-κB参与调控JEV激活的miR-15b的表达,并且miR-15b的表达依赖RIG-I。3.mi R-15b通过靶向RNF125调控JEV介导的炎症反应为了探究miR-15b在JEV感染过程中的生物学功能,通过gain of function和loss of function实验,我们发现miR-15b正向调控JEV诱导的炎性细胞因子及IFN-β的表达。对miR-15b发挥功能的分子机制进行分析,发现RIG-I的负调节子ring finger protein 125(RNF125)是mi R-15b的一个直接靶标。miR-15b能结合到RNF125 mRNA的3’UTR区域,抑制内源RNF125的表达。此外,mi R-15b通过靶向RNF125增加RIG-I的表达水平,进而促进RIG-I信号通路的激活。进一步通过靶基因RNF125的回复实验,证明miR-15b通过靶向RNF125调控JEV介导的炎性细胞因子的表达。4.体内验证miR-15b的功能为了在JEV感染小鼠模型中验证miR-15b的促炎作用,小鼠尾静脉注射化学修饰的miR-15b抑制剂antagomir-15b,小鼠未表现不良反应。体内试验结果显示antagomir-15b能抑制JEV感染小鼠脑组织中miR-15b的表达水平,回复RNF125的表达,降低炎性细胞因子的水平。通过对小鼠脑组织切片进行HE染色、免疫组化(IHC)及TUNEL分析,发现注射antagomir-15b的小鼠脑部病理变化减轻、星形胶质细胞和小胶质细胞的活化降低及神经元的凋亡减少。此外,antagomir-15b能提高致死剂量JEV感染小鼠的存活率,降低脑组织中病毒载量。本研究首次证明了mi R-15b在JEV与宿主细胞相互作用中扮演重要角色,初步阐明了JEV诱导miR-15b表达调控的分子机制,揭示了miR-15b在JEV诱导炎症反应中的调控机制,为深入揭示JEV诱导神经炎症反应的分子机制及脑炎性疾病的治疗提供了一种新思路。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65;R373.31

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