马链球菌马亚种间接ELISA方法的建立与应用

发布时间：2018-03-15 05:21

  本文选题：马腺疫　切入点：马链球菌马亚种　出处：《黑龙江八一农垦大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：马腺疫(Strangles)是由兰斯菲尔德C型(Lancefield C)成员马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)引起的一种马属动物传染病,呈急性接触性传播,传染性强,对世界各国马业造成了严重的经济损失。本试验根据Genbank中已经公布的S.equi重要的毒力因子及保护性抗原类M蛋白(Se M)的编码基因序列,设计出一对引物,以S.equi现地分离株全DNA组为模板,成功扩增出目的基因。将目的基因克隆至表达载体p GEX-6p-1中,将PCR鉴定和双酶切鉴定均阳性的重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta中,增菌培养后使用β-半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析,表明重组蛋白得到良好的表达。可溶性试验显示,重组蛋白以可溶性蛋白的形式存在于上清中,且蛋白分子量与预测值相符。Western blotting试验显示,纯化的重组蛋白能与S.equi阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的抗原性,可以用于血清学检测。以纯化的重组蛋白为包被抗原,采用方阵滴定法,确定抗原的最佳包被浓度和血清最佳稀释度。通过对酶标二抗工作浓度、显色条件等步骤进行优化,成功建立间接ELISA方法。通过对S.equi标准阴性血清进行测定,计算出平均数及标准差以确定此方法的判定值。通过特异性试验、重复性试验对此ELISA方法的特异性、稳定性进行测定。用本实验建立的方法对133份马血清进行检测,并与IDEXX ELISA试剂盒进行比较,本实验建立的间接ELISA方法敏感性、特异性和符合率分别为70.59%、74.14%、73.68%。本研究为马腺疫流行病学情况的调查提供了一种快速、简便的血清学检测方法,同时为S.equi诊断试剂盒的进一步研发奠定基础。
[Abstract]:Strangles is an infectious disease caused by Streptococcus equi subspecies subspecies S.equii, a member of Lancefield C in Langsfeld. A pair of primers were designed according to the important virulence factor of S.equi and the gene sequence of protective antigen M protein se M, which have been published in Genbank. Using the whole DNA group of S.equi field isolate as template, the target gene was successfully amplified. The target gene was cloned into the expression vector p GEX-6p-1, and the recombinant plasmid, which was positive for both PCR identification and double enzyme digestion, was transformed into Escherichia coli Rosetta. After culture, 尾 -galactoside isopropylthioglycoside (IPTG) was used to induce expression at 37 鈩，

本文编号：1614614