抗结肠小袋纤毛虫中草药的体外筛选

王丛丛,田欣欣,李三栋,卞志标,王天奇,闫文朝
（河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳  471003）

摘要：利用机率单位法，从30种中草药中筛选出16种半数致死浓度（LC50）低于100 g/L的中草药，分别是五倍子、常山、乌梅、葛根、百部、二花、甘草、黄芩、知母、槟榔、苦楝皮、诃子、贯众、使君子、巴豆和青蒿，可作为抗结肠小袋纤毛虫候选中草药，做进一步研究。
关键词：结肠小袋纤毛虫；中草药；机率单位法；半数致死浓度（LC50）
中图分类号：S852.72                 文献标识码：Ａ                 文章编号：1007－273X（２０１３）０3-0027-02

结肠小袋纤毛虫病（Balantidiosis）是一种人兽共患原虫病，目前已知人及非人灵长类动物、猪等33种动物可感染该病，其中猪感染最为普遍，是人和其他动物感染的重要传染源［1］。临床上常用于该病的硝基咪唑类药物有“三致”作用，已被要求禁用于食品动物［2］。利用体外急性毒性试验方法，筛选可用于抗结肠小袋纤毛虫的中草药，为人和动物结肠小袋纤毛虫病临床安全用药提供基本依据。
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1  虫种  试验用结肠小袋纤毛虫滋养体为河南科技大学寄生虫课程组保存，是取自然发病的病猪粪便，用DMEM培养基培养后获得的［3］。
1.1.2  试剂及药品  DMEM培养基，10.0 g装，Lot No.1342967，GIBCOTM，使用时按说明配成液体。五倍子、常山等30种中草药购自北京同仁堂（洛阳）有限公司。2%甲硝唑注射液，河南华利药业有限责任公司生产，批号为国药准字H41020499。
1.2  方法
1.2.1  中草药水提取物的制备  将备用的中草药加10倍体积的水浸泡3 h，之后用砂锅文火水煎2 h，将煎液用筛网滤出，余渣再加10倍体积水，文火水煎2 h，合并两次煎液，再用文火浓缩到每毫升相当生药0.5 g，高压灭菌并冷却后置2~8 ℃条件下备用［4］。
1.2.2  中草药抗结肠小袋纤毛虫效果的测定  每种中草药煎液均设计7个不同浓度梯度，用DMEM培养液将中草药煎液稀释成所需浓度的两倍。取8个灭菌小安瓿，每安瓿加培养48 h的虫体悬液1 mL，除第一个安瓿内加1 mL DMEM培养液作为对照外，其余安瓿内分别加入相应浓度的中草药煎液1 mL。上述小安瓿加盖后放入28 ℃的恒温培养箱中，2 h、6 h、12 h后取出观察。观察时，将每个小安瓿内液体充分混匀，吸取40 μL滴于载玻片上，加盖玻片，于100×镜暗视野下计数30个视野活虫数。试验时以甲硝唑为质控药物，以同样方法检测其不同时间的半数致死浓度（LC50）。因没有可参考的文献资料，试验所使用的药物浓度梯度是在多次预试验的基础上确定的。所有试验中草药若在100 g/L浓度范围内找到2 h半数致死浓度，则继续寻找6 h和12 h半数致死浓度，否则不再进行试验。
1.2.3  数据计算［5］   以对照（药物浓度为0 g/L）样品试验结束时所查获的活虫数（30个视野）为x，以该试验系列各样品试验结束时所查获的平均活虫数（30个视野）为y，将（x-y）/x 的数值换算为百分数，就是该浓度条件下的虫体死亡率。根据死亡百分率-机率单位换算表，将不同浓度下死亡百分率换算成死亡机率单位。在Excel图表系统下，以横轴表示药物浓度对数（lg LC50），以纵轴表示死亡机率单位，作xy散点图。顺着所获得的散点作一趋势线(直线)，并自动获得该直线的回归方程。经x2检验回归线符合要求后，利用该方程可求出死亡机率单位5（50 %死亡率）时的药物浓度对数，查反对数表就可获得LC50。利用回归方法的斜率求出lg LC50标准误差s，则lg LC50的95%置信限= lg LC50±1.96 s，查反对数表就可得到LC50的95%置信限。最后对中草药效果进行比较和评价。

2 结果与分析
    结肠小袋纤毛虫滋养体具有运动性，其在药物作用下运动能力逐渐减弱，最后停止运动，表膜破裂或消失。试验以甲硝唑为质控药物，试验中发现其2、6、12 h的半数致死浓度分别是457.80 mg/L、69.05 mg/L 、25.64 mg/L，同以往报道的结果一致。黄柏、连翘 、秦皮、栀子、苍术、苦参、白头翁、鸦胆子、黄连、鱼腥草、大青叶、公英、穿心连和仙鹤草在100 g/L的浓度范围内均未找到半数致死浓度，其抗结肠小袋纤毛虫效果较差。其余16种在100 g/L的浓度范围内找到2 h半数致死浓度，，并进一步确定了6 h和12 h半数致死浓度。由表1可见，2 h半数致死浓度由低到高的排序为五倍子、常山、乌梅、葛根、百部、二花、甘草、黄芩、知母、槟榔、苦楝皮、诃子、贯众、使君子、巴豆和青蒿。6 h和12 h半数致死浓度排序与之明显不同。

3 小结与讨论
    结肠小袋纤毛虫包囊经口感染人和动物，其在消化液的作用下破裂而释放出滋养体，后者在消化道内进行繁殖，人和动物免疫力下降或肠道受损时，其可侵入肠黏膜而致病。虽然硝基咪唑类药物具有很好的作用效果，但禁用于食品动物，病人使用时也会出现恶心、呕吐等消化道反应和头痛、眩晕等神经系统症状，非人灵长类动物也因其食口性差而拒食，且存在毒副作用的不确定性，用药后风险性较大。本试验参考有关水生动物急性毒性试验方法的基本原理，从 30 种中草药中初步筛选出 16 种对结肠小袋纤毛虫有效的品种，为体内消灭该虫体提供了理论依据。
    中草药煎液成分复杂，今后要用多种溶剂提取其不同有效成分，进一步研究其作用成分和作用机制。同时，还要利用动物试验对初步筛选出的中草药品种进一步研究，找出恰当的剂量及剂型，以便进行临床试验及推广。
参考文献:
［1］ 蒋金书．动物原虫病学［M］．北京：中国农业大学出社,2000．329-333．
［2］ 丁  涛,徐锦忠,沈崇钰,等．高效液相色谱-串联质谱联用测定蜂蜜中3种硝基咪唑类残留［J］．分析化学,2006，34(8)：1206．
［3］ 闫文朝,王天奇,丁  轲,等．DMEM培养结肠小袋虫的正交试验［J］．动物医学进展,2010，31(8)：34-37．
［4］ 胡元亮．兽医中药学［M］．北京：中国农业出版社,2007.164．
［5］ 周永欣，章宗涉．水生生物毒性试验方法［M］．北京：中国农业出版社，1989．114-122．

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