37℃下不同稀释液对鸡精子活率的影响

发布时间：2015-03-03 18:58

杨小霞1,张  娟2
（1.青海畜牧兽医职业技术学院，青海 湟源  812100；2.宁夏大学农学院，银川  753000）

摘要：配制了pH、渗透压接近的3种精液稀释液，37 ℃下每隔2 h测定鸡精子活率，直到全部精子死亡为止，计算精子存活时间和生存指数。结果表明，鸡精子在B稀释液中存活时间极显著高于A稀释液和C稀释液(P＜0.01)，A、C稀释液间差异不显著（P＞0.05）。鸡精子在A、B、C 3种稀释液中存活时间分别为（12.6±0.5） h、（14.0±0.3） h和（12.1±0.8） h，生存指数依次为5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8, 在A稀释液和B稀释液中生存指数极显著高于C稀释液(P＜0.01)，A稀释液和B稀释液差异不显著（P＞0.05）。
关键词：鸡精子；稀释液；渗透压；存活时间
中图分类号：S831；S814.3                文献标识码：A              文章编号：1007－273X（２０１３）０7-0012-03

目前在生产上常用的鸡精液稀释液有1%NaCl溶液，5%~7%葡萄糖溶液和葡萄糖卵黄溶液等，但实践应用效果不理想。精液稀释液各项指标是影响精子存活时间和生存指数的重要因素，尤其是稀释液的pH值、渗透压对精子生存指数的影响很大。尽管大量研究者对鸡精液稀释液的研究取得了很大进展，但如何根据鸡精子在体外生理特点和变化规律，研制出配方简单、价格低廉，易于推广应用的常温、低温、冷冻的家禽精液稀释液，还有待进一步的研究。陈元明等［1］研究认为鸡精子在2~5 ℃条件下可存活10 d，而在30 ℃以上则只能存活数小时。本试验制备了3种稀释液,将采集的鸡新鲜精液进行稀释后，37 ℃下每隔2 h观察一次精子活率，测定精子存活时间、生存指数等指标，以期了解提高温度后稀释液对鸡精液保存效果的影响。
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1  试验用鸡  30只14月龄蛋用型罗曼种公鸡为青海省畜牧兽医职业技术学院养禽示范园饲养。
1.1.2  试剂  葡萄糖、果糖、氯化镁、谷氨酸钠、醋酸钠、柠檬酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、EDTA-Na2、N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙烷磺酸（TES）、超纯水等。
1.1.3  仪器  精子质量评定系统、电子分析天平、渗透压仪、贝克曼温度计、数字pH计、普通温度计、显微镜、数显恒温水浴锅、集精杯等。
1.2  方法
1.2.1  稀释液的制备  鸡精液稀释液配方见表1，按配方准确称取所用试剂，溶解定容后用定性滤纸过滤，分装在250 mL瓶中，100 ℃高温高压灭菌15 min，，室温冷却后蜡封，阴凉处保存备用。
1.2.3  精液的稀释与保存  供试精液来自30只蛋用型罗曼种公鸡，公鸡经采精训练，采用背腹联合按摩法采集精液，并进行品质评定。将无粪尿污染精液混合，当活率大于0.6时供稀释保存之用。将采集的混合鲜精液与各稀释液按精液∶稀释液（V/V）1∶4等温稀释，分装于洁净的青霉素空瓶中，加盖后放入37 ℃恒温水浴锅中，保存观察。1.2.4  测定指标与方法  精子活率每隔2 h观察一次，检测时间与结果记入专用表格，直到全部精子死亡为止，最后计算精子存活时间和生存指数。过程中始终注意保存温度的恒定与无菌操作，试验重复4次。
1.2.5  渗透压及pH的测定  采用冰点下降法测定各稀释液的冰点下降度（Δt），按Δt/1.86×1 000换算为渗透摩尔浓度；使用PHS-2型酸度计测定各稀释液的pH。
1.2.6  数据处理  4次试验结果取平均值，计算每组数据的标准误，并进行了方差分析。
2   结果与分析
    3种稀释液渗透压和pH测定结果见表2。
    3种稀释液37℃下保存精液时精子存活时间与生存指数见表3，生存指数是指相邻两次精子活率均数与间隔时间乘积的总和。鸡精子在B稀释液中存活时间极显著高于A稀释液和C稀释液(P＜0.01)，A、C稀释液间差异不显著（P＞0.05）。鸡精子在A、B、C 3种稀释液中存活时间分别为（12.6±0.5）h、（14.0±0.3）h和（12.1±0.8）h，生存指数依次为5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8, 在A稀释液和B稀释液中生存指数极显著高于C稀释液(P＜0.01)，A稀释液和B稀释液差异不显著（P＞0.05）。
3  小结与讨论
3.1  释液液组成对精子保存的影响
    稀释液保存效果与稀释液组成有着密切的关系。本试验保存效果较好的A稀释液和B稀释液选择果糖、谷氨酸钠、氯化镁、柠檬酸钾等，在家禽稀释液中添加果糖效果要优于葡萄糖，并证实精子分解果糖速度较缓慢。张兆旺［2］研究结果显示，果糖稀释液中精子生存指数、存活时间和畸形率均优于蔗糖，葡萄糖效果最差。苏东顿等［3］也认为果糖是提高贮存精液受精能力的重要成分之一。
    Harrison［4］研究认为谷氨酸盐能延长鸡体外精子寿命。张兆旺［5］认为谷氨酸钠对精子有保护作用，并指出谷氨酸钠在单独配制稀释液时以每100 mL含2.40~2.47 g为宜。张兆旺等［6］报道表明在葡萄糖-磷酸盐类鸡精液稀释液中添加谷氨酸钠优于柠檬酸钠。张坚中等［7］认为稀释液中含有果糖、谷氨酸钠、柠檬酸钠和适量的K+、Mg2+能延长鸡精子寿命，同时还指出在盐成分上，柠檬酸钠优于氯化钾。适量的K+是维持精子正常机能所必需的，Mg2+具有保护精子运动和延长其寿命的机能。本试验中C稀释液保存效果较差可能是因为配方中选择了葡萄糖以及缺少适量的K+离子，从而影响了精子的存活时间。
3.2  稀释液pH对精子保存的影响
    研究显示，保存效果最好的鸡精液稀释液pH为6.8～7.2，此时受精率显著高于pH 5.8~6.2［8］。本试验中A、B和C3种稀释液的pH分别为7.0、6.9和7.3。由于精子代谢旺盛，能量消耗较快，导致代谢产物迅速积累，从而改变了pH，抑制了某些酶的活性，使精子丧失受精能力，故鸡精液稀释液pH要控制在一定范围之内。陈理盾等［9］观察了 9 种稀释液 pH对精子存活时间、生存指数的影响，其优等液 pH 6.7，精子存活时间 264 h，活率大于 0.6 的存活时间 148 h，pH范围在 6.7~7.2 的4 种良等液的保存效果达到了北京家禽稀释液（BJJX）的水平。李尚仁等［10］在鸡精液冷冻保存试验中，对精液稀释液进行了筛选，结果效果最好的稀释液pH为7.0，平均冻后活力达0.526。从以上试验结果可以看出,无论鸡精液是常温还是低温保存，欲使鸡精液保存效果好,稀释液的pH应与其生理范围尽量接近。
3.3  稀释液渗透压对精子保存的影响
    渗透压是鸡精液稀释液的重要参数之一，在鸡人工授精中，人们为寻找稀释液最佳的渗透压进行了大量的研究。本试验中A、B、C 3种稀释液的渗透压分别为318、327、307 mOs/kg，与鸡的精子生存较为适宜的稀释液渗透压（278~434 mOs/kg）相近。但李尚仁等［10］认为适宜渗透压是411~447 mOs/kg，陈元明等［1］指出在300~400 mOs/kg时为宜，同时30 ℃保存试验证明鸡精液随着稀释液渗透压的升高或降低，精子生存指数下降，而与鸡精液渗透压相近或偏高的稀释液中精子活力最好，存活时间最长。
    鸡精液稀释液能够为精子提供能量，保证适合鸡精子生存的pH环境，维持适当的渗透压和电解质平衡，中和缓解精子和微生物代谢产生的有害物质，冲淡精清中有害因子的浓度，延长精子在体外存活的时间，从而提高母鸡受精率。所以在稀释液配方物质的选择上应该综合考虑以上各种因素。
4  结论
（1）3种配方稀释液在37℃下保存效果较好的为B液，其次为A液，而C液保存效果较差。
    （2）配方中添加果糖、柠檬酸钾能够提高精子生存指数。
    （3）如果溶剂质量得不到保证，可以在配方中加入少量EDTA-Na2，能够保证稀释液清亮和保存效果。
参考文献：
［1］ 陈元明,廖纪朝,黄美玉,等.鸡精液稀释保存技术的研究［J］.中国农业科学,1987,20(6):52-57.
［2］ 张兆旺.稀释液溶质和渗透压对鸡精子体外存活及形态的影响［J］.中国家禽,2001,23(8):50-52.
［3］ 苏东顿,丁余荣,王桂朝,等.提高肉用种鸡人工授精效果的研究Ⅴ-肉用种鸡精液稀释液的筛选［J］.中国家禽,1993（4）:13.
［4］ HARRISON R J.Reproduction and reproductive organs in common seals (Phoca vitulina), in the Wash,East Anglia［J］. Mammalia ,1960(24):372-385.
［5］ 张兆旺.37℃下稀释液渗透压对鸡精子存活的影响［J］.甘肃畜牧兽医,2001,31(3):1-3.
［6］ 张兆旺,姚希芳.影响鸡精液3℃下保存效果的因素［J］.中国家禽,2002,24(13):23.
［7］ 张坚中,徐铁铮.家畜冷冻精液［M］.北京：中国农业科技出版社,1988.
［8］ 权  凯,肖曙光,黄炎坤.鸡精液稀释液研究进展［J］.河南畜牧兽医,2005,2(3):6-8.
［9］ 陈理盾,权  凯,黄炎坤.鸡精液稀释液的选择及其影响因素分析［J］.中国家禽,2011,33(1):45-46.
［10］ 李尚仁, GRAHAM E F.不同处理对5℃保存的鸡精液的影响［J］.中国农业科学,1986(3):83-89.

 

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