鹌鹑源禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定及在体内分布的研究

发布时间：2018-03-22 09:12

本文选题：鹌鹑　切入点：禽脑脊髓炎病毒　出处：《西北农林科技大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：禽脑脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)是由禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的一种主要侵害幼禽中枢神经系统的接触性传染病。AEV为无囊膜单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科,震颤病毒属。该病目前只能依靠疫苗免疫进行防控,因此,运用灵敏准确的方法测定AEV在鹌鹑体内的动态分布对于AE的致病性研究及其防治具有重要作用。本研究对鹌鹑源AEV进行分离鉴定,并运用荧光定量PCR技术和免疫组织化学试验检测AEV XY/Q-1410株口服感染1日龄鹌鹑后病毒在其体内的分布情况,结果如下:1.2014年10月采集陕西省咸阳市某鹌鹑养殖场AE疑似病料,经鸡胚传代、RT-PCR扩增、中和试验及动物回归试验对病原体进行分离鉴定。RT-PCR扩增结果显示,用AEV特异性引物成功扩增到大小为288 bp的目的片段,与参考株核苷酸序列相似性及推导的氨基酸序列相似性分别为84.9%~99.3%和95.8%~98.9%;遗传进化分析表明,分离株与SX株位于同一分支;中和试验结果显示,中和指数为102.32,大于50,为阳性;动物回归试验结果显示,攻毒组鹌鹑及雏鸡均出现典型的AE临床症状,攻毒组鹌鹑发病率55.1%,病死率100%,攻毒组雏鸡发病率60%,病死率58.3%,病理剖检发现患病动物的脑组织软化,脑半球轮廓变模糊,对照组未见异常。本研究成功分离到一株鹌鹑源AEV,命名为AEV XY/Q-1410株。2.标准曲线的建立。通过TIANLONG 988荧光定量PCR系统对10倍递比稀释的重组质粒标准品(102~108 copies/μL)产生的循环数与扩增子对数浓度的线性回归分析得到标准曲线:曲线斜率为-3.325,相关系数(R2)为0.9978。检测限度为100拷贝。3.用荧光定量PCR技术测定AEV在鹌鹑体内的动态分布。运用荧光定量PCR技术测定AEV XY/Q-1410株接种鹌鹑后第3天~17天(间隔1天),18天~25天(每天),29天,30天,32天,36天~48天(间隔1天),49天,51天~60天(每天)在鹌鹑大脑、小脑、腺胃、肠道、肝脏、胰腺、脾脏、法氏囊、肺脏、肾脏等器官中的病毒载量。结果显示,病毒在多数组织中可以持续感染长达60天。大脑和小脑中的病毒载量逐渐升高至第18天达到第一个峰值,第二个峰值分别出现在攻毒后第51天和46天。腺胃、肠道、脾脏和法氏囊中的病毒载量高于大脑和小脑。腺胃中的病毒载量从第3天至第46天呈“U”型,之后逐渐降低至第52天,之后保持稳定至第60天;肠道中的病毒载量从第3天至第46天呈“M”型,之后保持稳定至第60天;肝脏中病毒载量波动较剧烈,最大值出现在第52天;胰腺中的病毒载量通常低于100拷贝。脾脏中的病毒载量从第3天至第54天呈“W”型,之后缓慢下降至第60天;法氏囊中的病毒载量从第3天至第44天呈“U”型,然后下降至第49天,之后病毒载量小幅度波动至第60天。肺脏中的病毒载量整体呈两个“M”型相连。肾脏中的病毒载量仅在第7天出现一个峰值,从第15天至第60天保持轻微波动。4.用免疫组织化学试验检测AEV的组织分布。运用免疫组织化学试验来检测攻毒后第7天,18天,36天,54天和59天所采集的各组织器官中病毒粒子的分布并结合Image-Pro Plus软件来计算各时间点各组织器官中病毒蛋白相对表达量。结果显示,五个时间点所采集的组织器官中均有明显的棕黄色阳性染色,而阴性对照没有。将各组织器官中病毒蛋白相对表达量与病毒载量进行相关性分析,结果显示,二者呈正相关。综上所述,AEV XY/Q-1410株与SX株亲缘关系最近,而与L2Z株、YL株、1143株、Van Reokel株和Pf-CHK1/AEV株亲缘关系较远,表明AEV XY/Q-1410株与参考株相比,在遗传进化上存在一定差异。荧光定量PCR结果表明,AEV可持续感染长达60天,腺胃,肠道,脾脏和法氏囊中的病毒载量高于大脑和小脑。相关性分析结果表明,各组织器官中的病毒基因拷贝数与病毒蛋白相对表达量呈正相关。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.39

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