梅花鹿VEGF基因的克
本文选题：梅花鹿 切入点：鹿茸 出处：《吉林农业大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：鹿茸是雄性梅花鹿或马鹿的带有红黄色或棕黄色细茸毛未长成硬骨时的嫩角,也是哺乳动物中唯一能够完全再生的器官。人们逐渐发现鹿茸具有特殊的分子机理,有很高的研究价值。随着研究深入,鹿茸细胞生长因子已经被认为是调节鹿茸再生发育的主效因子之一。近年,细胞生长因子的研究已经成为热点,其中血管内皮生长因子(VEGF)已经被证实存在于鹿茸顶端组织中。在鹿茸组织的快速生长中,血管的分布也越来越旺盛。血管内皮生长因子是一种促生长和修复蛋白,特异性地作用于血管内皮细胞,促进其增殖,提高血管的通透性,改善血液循环,在鹿茸血管生成和发育过程中起着重要的调节作用。因此,本研究将对梅花鹿VEGF基因的功能进行初步研究,为深入探讨梅花鹿VEGF基因对鹿茸生长的调节机制提供理论依据,也为鹿茸细胞因子在再生医学和肿瘤医学的快速发展提供参考依据。本实验利用PCR技术获得梅花鹿VEGF基因,纯化回收目的片段,并插入到pMD-18T载体中,转化进入宿主菌大肠杆菌DH5ɑ中挑选出阳性菌对其进行PCR反应和双酶切反应鉴定,并进行测序。采用免疫组化法检测鹿茸VEGF蛋白在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层的表达水平。再构建原核表达载体pET-30a-VEGF,转化大肠杆菌Rosetta宿主菌中,筛选高效率转化子,并摇瓶培养,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测,经镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,并进行目的蛋白复性,经Western blotting检测重组蛋白VEGF抗原活性,最后利用MTT法检测重组蛋白VEGF对鼠成纤维细胞NIH3T3增殖的影响。实验结果表明,克隆获得VEGF基因序列,长度为519bp,与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%,与牛、羊、猪的氨基酸序列同源性分别为98.79%、97.78%、96.36%。免疫组化结果表明VEGF蛋白在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,但是没有明显差异。Western blotting结果表明,鹿茸VEGF重组蛋白具抗原活性,MTT实验表明VEGF重组蛋白对鼠成纤维NIH3T3细胞具有一定的增殖作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S825
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，本文编号：1650458
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