鸡PGCs生成过程中C1EIP基因调控机制的研究

发布时间：2018-03-25 18:03

  本文选题：鸡　切入点：PGCs　出处：《扬州大学》2017年博士论文

【摘要】：生殖细胞可以把生物的遗传信息传递给下一代,维持生命的传递,对生殖细胞分化研究具有重要意义。原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是所有生殖细胞的始祖细胞,能够在性腺中分化为精原干细胞(Sperrmatogonial stem cells,SSCs)或卵原干细胞(Ovary stem cells,OSCs),进而进一步发育分化为精子或卵子。PGCs的发生受到许多内源性调控因子和细胞外基质等外源因素的调控,这些因子通过不同的信号通路,构成复杂的调控网络,直接或间接地调控PGCs的形成。目前,研究者们通过体外分离培养、体外诱导、构建转基因细胞等方多种方式对PGCs的生长和分化进行了大量的研究,然而关于调控PGCs发生过程的具体调控网络分子机制却知之甚少,因此PGCs发生过程机制的探究成为近年来备受关注的焦点。随着PGCs研究的深入,研究者们已经探究发现存在一些关键性的基因、信号通路、生长因子以及表观遗传修饰因素在此过程中起到重要的调控作用,随着这些因素对于PGCs发生起到了一定的促进作用,但是并没有真正从意义上提供提高PGCs生成效率,进而无法满足相关的科研需求,因此亟需对从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的产生过程,从而获取大量的PGCs。为了进一步探究调控PGCs发生及分化的作用机制,从根本上解决PGCs生成效率低下的问题,本研究基于本实验室前期对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、PGCs和SSCs的RNA-Seq测序结果中筛选到PGCs特异表达的新基因LOC418414(Genbank登录号:XM_416629.3)的基础上,根据其表达位置命名为C1EIP,对其在鸡ESCs向PGCs分化过程中从体内和体外两个水平上进行系统的功能和机制验证,深入了解家鸡ESCs向PGCs分化过程的调控机制,为有效提高ESCs向PGCs诱导分化效率提供理论依据和参考,并且为鸡ESCs向PGCs分化其他类似关键功能基因的功能及机制研究提供理论基础。研究结果如下:1.为了有效确定候选特异基因C1EIP在的生物功能以及其真核细胞中的定位,为后期功能及机制研究奠定基础,对C1EIP进行生物信息学分析显示,C1EIP主要与鸟类同源性较高,但同源蛋白为未知蛋白,未发现特异的结构域。我们结合NCBI数据库提供的C1EIP编码序列,利用RT-PCR扩增C1EIP编码区,分别构建重组表达载体pEGFP-C1EIP 和 pcDNA3.0-C1EIP。以 pEGFP-C1EIP 和 pcDNA3.0-C1EIP 转染 DF1 细胞,确定C1EIP的定位,并以RT-PCR和Western Blot检测C1EIP在真核细胞中转录和翻译的情况;同时以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP载体,肌肉注射小鼠后采血制备抗小鼠血清,以IFA和Western Blot检测抗体效价。酶切及测序结果均显示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP载体构建成功。pEGFP-C1EIP转染DF1细胞后,C1EIP表达于细胞质中,说明C1EIP定位于细胞质中,且能够启动转录和翻译;以1μg:1.5μg的比例将PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP产物注射小鼠肌肉制备抗小鼠血清,IFA检测最佳效价为1:25,并以此效价进行Westen Blot检测显示能够识别到C1EIP蛋白。2.为了探究C1EIP在鸡PGCs生成过程中生物学功能探究,我们针对C1EIP编码区设计3个shRNA靶位点和1个阴性对照位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。在体外,以慢病毒干扰载体和过表达载体分别转染2代ESCs细胞,结合RA诱导剂诱导,观察ESCs形态变化,并以qRT-PCR、细胞免疫化学和流式细胞分析检测PGCs生成效率;在体内,以慢病毒RNA干扰载体侵染鸡胚,摸索出最佳的侵染效率,侵染后的鸡胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫组化以及流式细胞分析等方法检测PGCs生成效率。结果显示成功构建慢病毒干扰载体C1EIP-shl、C1EIP-sh2 和 C1EIP-sh3,干扰效率分别为 80.39%、87.80%和 38.36%。在体外,正常RA诱导在第2d出现小类胚体(Embryoid Body,EB),在第4d时类胚体增多、变大,第6d类胚体的边缘开始出现裂口,并且伴随有少量的细胞从类胚体内部释放,第8d时类胚体严重破裂,大量细胞释放,在第10-12d类胚体基本上裂解完全,出现类精原干细胞(Spermatogonial stem cells-like,SSCs-like),并聚团成葡萄串状克隆;过表达组中,在第2d出现大的类胚体,第4d类胚体边缘开始出现小缺口,第6d类胚体大部分破裂并释放大量内部细胞,第8d出现类SSCs细胞,第10-12d出现典型的呈葡萄串状的SSCs克隆;在敲低中,第2-6d细胞未出现类胚体,第8d开始出现小的类胚体,然而培养至12d类胚体的数量、大小以及形态并未出现明显的变化;qRT-PCR结果显示过表达C1EIP后,全能性基因sox2表达量总体上由1.00±0.04持续降低至0.14±0.01,而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1表达量自始至终都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03 和 2.59±0.05,目的基因 C1EIPP 表达量在第 4d 上升至3.99±0.06,在第12d时由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后,sox2表达量在第0-12d中没有显著的变化,cvh、c-kit和C1EIP表达量分别由1.00±0.02、1.00±0.01和1.00±0.02稳定持续下降至 0.55±0.01、0.70±0.01 和 2.87±0.07,Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1表达量由 1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03 和 1.00±0.04 分别先下降至 0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03 和 0.76±0.02,然后再略微上升至 0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0.93±0.08;细胞免疫化学结果显示相对于RA诱导组,过表达组显著增加CVH和C-KIT的表达,而敲低组抑制CVH和C-KIT的表达。流式细胞分析结果显示,RA诱导组中CVH+细胞比例为3.4%,在过表达C1EIP后,CVH+细胞比例显著上调至4.6%,然而敲低C1EIP使得CVH+细胞降低至2.9%。在体内,鸡胚注射慢病毒载体的最佳条件为钝端注射10μL 106TU/mL慢病毒干扰载体+90μL DMEM,注射后能够稳定表达egfp且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示各个基因的表达量在Blank组和sh-Ctrl组之间没有显著的变化,而在敲低C1EIP后,全能性基因sox2的表达量下降趋势相对于其他分组有所减缓,而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖相关基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0.04和0.22±0.03;PAS结果显示敲低C1EIP能够显著降低PGCs的产生。免疫组织化学结果显示空白组和阴性对照组中生殖嵴中高度表达CVH和C-KIT,且表达部位几乎充满整个生殖嵴中,然而在敲低组中,CVH和C-KIT蛋白表达明显降低,并且表达的部位仅仅局限于生殖嵴的边缘部分。流式细胞分选结果显示,相对于空白组和对照组(4.6%和4.3%),敲低C1EIP使得CVH标记的PGCs比例明显下调至3.1%。3.为了系统有效地阐明C1EIP表达的转录水平调控机制,我们结合NCBI和UCSC数据库中查询C1EIP转录起始位点上游启动子2000bp左右的序列,扩增C1EIP启动子长片段,克隆至pEGFP-N1载体中,置换CMV启动子,构建重组表达载体pC1EIP-EGFP,转染至DF1细胞中检测C1EIP启动子长片段的启动活性;通过缺失片段克隆技术,构建C1EIP启动子不同缺失片段载体PGL3-P1～PGL3-P10,转染DF1细胞后以双荧光素酶报告系统检测各个缺失片段的启动子活性,筛查出C1EIP启动子核心调控区域;在此区域以生物信息学预测关键转录因子结合位点,并对各个转录因子结合位点分别进行定点缺失,构建缺失载体,同样以双荧光素酶报告系统检测转录因子结合位点缺失对启动子活性的影响;最后分别 10μmol/L、1μmol/L 和 4mmol/L 的 5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和 valproic acid(VPA)处理,检测 DNA 甲基化和组蛋白乙酰化对C1EIP启动子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表达变化的影响。酶切及测序结果均表明pC1EIP-EGFP构建正确,转染DF1细胞后能够激发绿色荧光,定性地说明扩增的C1EIP启动子长片段具有启动活性;同时启动子各个缺失片段载体酶切和测序结果也表明载体构建成功,双荧光素酶检测启动子活性结果显示P4-P6间,即-1025～-912bp为C1EIP启动子的核心活性区域;在此区域内关键的转录因子结合位点包括MEISS1、MAFG::NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1::Tcf3 其中只有STAT3起到正向调控作用;最后发现在DNA甲基化抑制5-Azadc以及组蛋白乙酰化抑制剂TSA和VPA处理后,C1EIP 启动子活性由 10.82±0.54 上升至 18.49±0.72、33.27±0.83 和 38.11±0.53,同时5-Azadc、TSA和VPA处理后,C1EIP在鸡ESCs、PGCs和SSCs中表达量分别由1.00±0.23、5.73±0.54、0.94±0.23 变化为 1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18 和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16 以及 2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。4.为了探究C1EIP调控PGCs生成的机制,我们通过构建C1EIP原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中表达,以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白,构建融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA,以体外免疫共沉淀技术验证ENO-HA和C1EIP-EGFP间互作关系。结合在线数据库,以生物信息学分析技术探究互作基因ENO1的关联基因,以qRT-PCR验证其在PGCs生成过程中的表达变化情况。通过构建Myc启动子的双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1,同时为了消除同源家族基因的干扰,我们还构建了ENO2的重组表达载体pcDNA3.0-ENO2,结合之前构建完成的pcDNA3.0-ENO1-HA载体,共转染DF1细胞,以双荧光素酶报告系统检测Myc启动子活性变化情况,并根据所得结果和查找相关文献,绘制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图。GST pull-down结果显示C1EIP与ENO1之间存在互作,且体外免疫共沉淀验证C1EIP之与ENO1间的互作关系。通过Uniport和PSORT Ⅱ数据库以及共表达网络分析发现ENO1定位于细胞质中,与Myc相互关联,Myc下游基因为Notch1。qRT-PCR结果显示C1EIP和ENO1在鸡ESCs向SSCs分化过程中表达趋势保持一致,并且与Myc和Noth1表达趋势相反。酶切和测序结果显示双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均构建成功,且双荧光素酶检测结果显示MBP-1对Myc启动子活性存在抑制作用,而ENO1和ENO2对其没有影响。最后根据以上结果和相关文献报道绘制C1EIP和MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图,结果显示C1EIP可能作为锚定蛋白将ENO1蛋白固定于细胞质中,当ENO1发生磷酸化或去磷酸化后,C1EIP将其释放,并易位入核,在易位过程中丢失前面96个氨基酸残基,形成MBP-1蛋白,从而结合至Myc启动子,抑制其转录,进而阻断Notch信号通路的信号传导,最终反向促进鸡ESCs向PGCs方向分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 李碧春,陈国宏,赵东伟,钱菊汾;鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养[J];中国兽医学报;2001年04期

2 韩威;李碧春;秦洁;朱云芬;陈国宏;;不同冷冻剂对鸡胚PGCs的保护效应[J];中国兽医学报;2007年03期

3 胡小芬,李震,张德福,黄启忠,黄路生;鸡的原生殖细胞(PGCs)体外操作及其研究进展[J];云南畜牧兽医;2002年04期

4 李玉芳;洪志勇;李明;张兴峰;林秀娇;李鸿翔;庄益芬;张文昌;;鹌鹑PGCs的传代培养及鉴定[J];福建畜牧兽医;2013年03期

5 胡小芬;艾华水;;鸡原生殖细胞(PGCs)的提纯及其超低温保存[J];江西农业大学学报;2008年06期

6 马玉忠,李赞东,沙金,刘春海,王宁;供体PGCs在鸡-鸭嵌合体胚胎性腺外的发育[J];中国兽医学报;2002年04期

7 李碧春,陈国宏,赵东伟,王克华,钱菊汾;鸡胚PGCs迁移与性腺发育关系的研究[J];扬州大学学报;2002年01期

8 ;Improved Isolation and Culture of Embryonic Germ Cells from Guanzhong Dairy Goat[J];Agricultural Sciences in China;2006年07期

9 冯书堂,董晓,刘立新,牟玉莲,况玲,陈红平,张莉,张勇,张青峰;猪原始生殖嵴细胞(PGCs)建系因素的研究[J];畜牧兽医学报;2004年05期

10 H. Furuta,N. Fujihara;Proliferation of exogenously injected primordial germ cells (PGCs) into busulfan-treated chicken embryos[J];Asian Journal of Andrology;1999年04期

相关会议论文 前4条

1 冯书堂;董晓;刘立新;牟玉莲;况玲;陈红平;张莉;张勇;张青峰;;猪原始生殖嵴细胞(PGCs)建系因素影响研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

2 常国斌;陈蓉;陈国宏;;Piwill基因在鸡PGCs中的体外抑制研究[A];中国畜牧兽医学会家禽学分会第九次代表会议暨第十六次全国家禽学术讨论会论文集[C];2013年

3 杨学义;冯秀亮;雷安民;李伟;窦忠英;;皮肤源PGCs样多潜能干细胞的分离与鉴定[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

4 ;Apoptosis of Primordial Germ Cells[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年

相关博士学位论文 前4条

1 李海涛;RTN3对CXCR4表达及原始生殖细胞迁移的影响[D];中国农业大学;2016年

2 李东;鸡PGCs生成过程中C1EIP基因调控机制的研究[D];扬州大学;2017年

3 刘羿羿;山羊类胚胎干细胞和PGCs的培养与鉴定[D];内蒙古农业大学;2010年

4 张易祥;2，2’5，，5’-四氯联苯和雌二醇对鸡生殖功能的影响[D];中国农业大学;2005年

相关硕士学位论文 前6条

1 魏玲海;小鼠PGCs的分离鉴定及体外培养初步研究[D];内蒙古大学;2015年

2 李美洁;牙鲆原始生殖细胞的标记及其迁移机制的初步研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2015年

3 陈美娟;体外培养的鸡原始生殖细胞在早期胚胎迁移的研究[D];广西大学;2016年

4 程旭梅;鹌鹑胚胎早期PGCs迁移规律以及性腺发育的研究[D];扬州大学;2009年

5 时小艳;小鼠原始生殖细胞（PGCs）中组蛋白H2A变体的分布[D];南京农业大学;2008年

6 薛安永;鸡与鹌鹑属间杂交早期胚胎中PGCs的观察及Aromatase，ER基因的表达分析[D];石河子大学;2008年

本文编号：1664244