检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

发布时间：2018-03-25 22:13

  本文选题：鼻气管鸟疫杆菌　切入点：禽　出处：《中国兽医学报》2017年03期

【摘要】：利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。
[Abstract]:The 16s rRNA gene of Ortobacillus rhinotracheae published on GenBank was sequenced by DNAStar. According to the analysis results, a pair of specific primers were designed to amplify the partial conservative gene sequence of 16SRNA and clone it into pMD18-T vector. The recombinant plasmid was identified and purified as a positive standard for the establishment of SYBR Green 鈪，

本文编号：1665077