猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10解旋酶关键活性位点的研究及酶抑制剂的筛选

发布时间：2018-03-26 17:57

  本文选题：猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)　切入点：Nsp10　出处：《华中农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)属于动脉炎病毒科正链RNA病毒。自1990年被发现以来,猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)迅速成为猪产业最重要的病毒疾病之一。它主要表现为母猪早产、流产、死胎或弱仔;公猪精液品质下降;初生仔猪高死亡率;其它年龄猪呼吸系统疾病。这个病毒还在继续进化,变异的病毒毒力增强导致大批猪死亡和流产,甚至引起非典型的猪繁殖与呼吸综合征。在防治PRRS可行的策略中,疫苗是控制PRRSV感染最主要的方法。然而目前市面上使用的灭活疫苗和减毒疫苗都不能有效控制PRRSV的感染。另外PRRSV感染本身会延缓中和抗体的出现以及导致宿主T细胞免疫反应的削弱,这也是疫苗免疫效果差的原因。因此很有必要找到控制PRRSV的有效方法。动脉炎病毒Nsp10蛋白参与病毒增殖的很多过程,包括sgRNA的合成、mRNA的早期转录、基因组复制和病毒粒子的生成。将高致病性PRRSV毒株和弱毒株的基因组序列进行比对,发现Nsp10蛋白的突变可能与病毒的毒力相关。而除了2002年报道过PRRSV Nsp10的功能特性之后,以后的十几年里鲜有报道。因此,开展Nsp10蛋白的关键活性位点的研究及酶抑制剂的筛选,对于解开Nsp10蛋白的解旋机制和抗PRRSV药物的开发有重要指导意义。本研究首先通过原核表达并使用镍柱亲和层析纯化获得高活性的Nsp10解旋酶,使用化学发光试剂盒和荧光共振能量转移的方法建立测定Nsp10蛋白ATP水解活性和解旋活性的最佳检测体系。并且构建了一系列Nsp10蛋白突变体。通过测定它们的活性,分析Nsp10蛋白保守基序Ⅰ和Ⅱ中的关键氨基酸位点。而且进一步建立解旋酶抑制剂高通量筛选体系;对SPECS公司碎片库的4536种化合物碎片进行筛选,找到抑制Nsp10蛋白解旋活性的小分子化合物。最后测定这些化合物在细胞水平上的抗病毒活性。另外,本研究中还为解析Nsp10蛋白的结构作出了努力。主要实验结果如下:1.Nsp10蛋白的原核表达、亲和层析纯化和活性检测体系的确定经过对表达条件的筛选,最终确定Nsp10蛋白在原核表达质粒pET30a-Nsp10中,16。C诱导16h可表达于上清之中。通过镍柱亲和层析纯化获得了较纯的Nsp10融和蛋白并用SDS-PAGE胶和Western blot进行了鉴定。然后,用Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay Kit检测Nsp10蛋白ATPase活性,通过对各种条件的摸索建立了最佳反应体系,即反应温度37。C、反应时间30min、缓冲液条件为pH7.9、2mM MgCl2、0.6μM Nsp10蛋白和0.2mM ATP。并发现实验中纯化得到的Nsp10蛋白中本身螯合一定量的金属离子。同时,利用荧光共振能量转移的原理建立Nsp10蛋白解旋活性的最佳检测体系:反应温度37。C,反应时间90min,缓冲液条件为pH7.9、2mM MgCl2、80μM Nsp10蛋白、400 nM双链荧光底物、4μM捕获链和0.2mM ATP。2.Nsp10蛋白保守基序Ⅰ和Ⅱ中的关键活性位点的研究通过重叠PCR定点突变Nsp10蛋白的不同位点获得一系列突变体,检测突变体蛋白的ATPase和解旋活性。结果发现,突变体蛋白K155A和E226A的ATP水解活性分别下降了88.1%和8.0%。其他位点氨基酸的突变几乎不影响Nsp10蛋白的ATP水解活性。证明了Nsp10蛋白K155氨基酸是ATPase活性的关键位点。突变体蛋白K155A、D225A、E226A、A228V和A228D的解旋活性均有所下降。其中突变体蛋白D225A和A227S的解旋活性分别下降了77.0%和99.3%。突变体蛋白D225A和E226A的ATP水解活性和解旋活性都显著减弱。当227位的丙氨酸突变为丝氨酸时,蛋白的解旋活性几乎丧失;而当突变为缬氨酸的时候,蛋白的解旋活性反而增强。结果说明D225和E226氨基酸与ATP水解和双链解旋过程都有关联;A227氨基酸是解旋活性的关键位点。3.解旋酶抑制剂的高通量筛选和细胞水平上验证化合物的抗病毒活性建立高通量筛选模型,从SPECS公司4536种小分子碎片中筛选得到能抑制Nsp10蛋白的解旋活性且抑制率大于50%的18种化合物。将这18种化合物进行细胞水平的抗病毒活性研究,发现没有明显的抑制病毒增殖感染的作用。4.Nsp10蛋白结构的研究将通过Ni柱亲和层析纯化得到的Nsp10蛋白,再通过凝胶过滤层析使得蛋白纯度达到95%以上。将高纯度Nsp10蛋白使用超滤管浓缩至浓度大于5mg/ml,然后对蛋白结晶条件进行摸索和优化。最后发现Nsp10蛋白在2.2M NaCl,1.0M HEPES pH7.5的缓冲液中可以长出圆柱形质量较好的晶体;但是晶体分辨率最好只有3.6?,还不能解析Nsp10的结构。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：1668937