应用金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15治疗乳房炎的实验研究

发布时间：2018-03-28 02:02

  本文选题：奶牛乳房炎　切入点：金黄色葡萄球菌　出处：《吉林大学》2015年硕士论文

【摘要】：奶牛乳房炎（Bovine Mastitis）是畜牧养殖业和食品安全危害较大的一种疾病，，给人们带来了巨大的损失。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一。长期以来有效的治疗手段是使用抗生素，但是近年来由于对抗生素不合理的使用，导致了多重耐药菌株的出现，给乳房炎的有效治疗带来了极大的困难。而噬菌体的裂解酶可以特异的杀灭病原菌，并且对耐药细菌同样有效，很有潜力成为控制耐药性细菌的有效药物。本实验室前期获得了对金黄色葡萄球菌具有广谱、高效裂解活性的噬菌体裂解酶LysGH15，并揭示了其三维结构和分子作用机制。在前期的基础之上，本研究通过利用噬菌体裂解酶LysGH15快速杀灭金黄色葡萄球菌的能力，对金黄色葡萄球菌引起的乳房炎模型进行治疗研究，以探寻利用该裂解酶治疗奶牛乳房炎的潜力。 首先，对金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15进行了表达条件和纯化条件的优化。表明在20℃低温诱导6h可获得最大表达量，经150mM咪唑浓度的buffer洗脱液纯化最终获得了纯度较高的裂解酶LysGH15，经过浓缩后测定其浓度为7.18μg/μL。采用平板分析法和浊度递减实验对所获得的裂解酶LysGH15进行体外活性的测定，表明在37℃条件下浓度为1.0μg/μL的LysGH15经过12h在涂抹有ATCC49525菌株的LB固体培养基平板上形成明显的抑菌环；在浊度递减实验中经10min OD600从1.0下降到0.4。上述实验均表明裂解酶LysGH15在体外具有明显的杀菌活性。 利用金黄色葡萄球菌ATCC49525建立小鼠乳房炎感染模型。将21只泌乳一周左右的母鼠随机分为空白对照组、PBS组和5个感染组，每组3只。对于空白对照组的母鼠不做任何处理；而PBS组则对母鼠的第4、5对乳腺灌注PBS；感染组对母鼠的第4、5对乳腺灌注105cfu/50μL的金黄色葡萄球菌ATCC49525，并且对5个感染组的母鼠分别经过8h、12h、24h、48h、72h后处死。然后通过肉眼观察临床症状、病理解剖、制作病理切片对病理组织的变化进行分析、ELISA测定乳腺组织细胞因子TNF-α水平。结果表明，与阴性对照组和PBS组对比，感染金黄色葡萄球菌48h后母鼠乳腺有明显的临床症状，出现红、肿、热、痛的病理变化；乳腺组织内的结构发生变化，乳腺腺泡大量崩解，大量炎性细胞浸润，间质变宽模糊不清，炎症反应明显；促炎因子TNF-α的水平显著升高。所有这些结果均表明小鼠乳房炎模型构建成功。 应用浓度为1.0ug/μL的金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15对小鼠乳房炎模型进行治疗，结果表明小鼠在感染后1h给予裂解酶低剂量（10μL）进行治疗，使乳腺内的菌含量得到了显著下降，乳腺组织内的TNF-α、IL-6等炎性因子的水平也显著降低，减少了腺泡内的炎性因子的浸润，并且有效的缓解炎症反应；而感染后8h给予裂解酶高剂量（50μL）进行治疗，同样能起到显著的治疗效果。综上，金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15对金黄色葡萄球菌造成的小鼠乳房炎模型表现出良好的治疗效果，这为后续奶牛乳房炎的防治奠定了坚实的基础。
[Abstract]:Bovine Mastitis is one of the most important pathogens in livestock breeding and food safety . Staphylococcus aureus is one of the most important pathogens causing cow mastitis .

First , the expression condition and purification conditions were optimized for S . aureus phage lysate . The results showed that the maximum expression can be obtained at low temperature of 20 鈩

本文编号：1674241