褪黑素对热应激猪卵母细胞体外成熟的影响

发布时间：2018-03-28 18:17

  本文选题：卵母细胞　切入点：热应激　出处：《河北农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：本试验的目的是研究热应激对猪卵母细胞体外成熟的影响,以及在成熟培养基中添加褪黑素对热应激猪卵母细胞体外成熟的作用。以猪卵巢中分离出的GV期COCs为研究对象,通过体外41℃生理热应激4h后成熟至MII期,对卵母细胞中线粒体DNA拷贝数、胞质中线粒体分布情况、线粒体染色荧光强度、核编码线粒体相关基因和线粒体编码基因的表达进行检测,以及观察孤雌激活后胚胎的发育情况。将猪卵母细胞按对照组(C组)、正常培养加10-9M褪黑素组(C+M(-9)组)、正常培养加10-8M褪黑素组(C+M(-8)组)、热应激组(H组)、热应激加10-9M褪黑素组(H+M(-9)组)、热应激加10-8M褪黑素组(H+M(-8)组)随机分成6组,体外成熟培养至MII期,孤雌激活后观察胚胎发育情况,试验结果显示:与C组相比,C+M(-8)组能够显著提高猪卵母细胞的囊胚发育率(P0.05);在H组中,热应激显著的降低了囊胚发育率(P0.05),热应激培养基中添加褪黑素能够提高囊胚率(P0.05),但是H+M(-8)组能够显著的提高囊胚率(P0.05)而H+M(-9)组只有提高的趋势但差异并不显著(P0.05)。其中卵母细胞的卵裂率并不受不同处理的影响,各处理的卵裂率差异不显著(P0.05)。线粒体拷贝数可作为衡量卵母细胞成熟的重要指标之一,本试验进一步研究热应激对猪卵母细胞中mt DNA拷贝数的影响。同样卵母细胞随机分成六组,成熟培养至MII期,利用RT-PCR方法对卵母细胞中mt DNA拷贝数进行量化,试验结果表明:与C组相比,C+M(-8)组显著的提高了卵母细胞中mt DNA拷贝数(P0.05);在热应激的条件下,H组的mt DNA显著降低(P0.05),而H+M(-9)组和H+M(-8)组都能够显著的提高mt DNA拷贝数(P0.05)。这与孤雌胚胎发育的数据吻合,说明热应激降低卵母细胞的发育潜能是通过减少胞质中mt DNA拷贝数来影响卵母细胞胞质的成熟。在卵母细胞成熟过程中,线粒体的分布也随成熟的过程发生移位。利用Mito-Tracker染色观察MII期猪卵母细胞中线粒体的分布情况。与C组相比,H组中细胞胞质中线粒体分布不均,出现空洞,而H+M(-8)组中,线粒体又恢复了正常的分布。这说明褪黑素也通过影响线粒体的分布来提高卵母细胞成熟的质量。同时对Mito-Tracker染色荧光信号强度进行定量分析得出,与C组相比,褪黑素能够显著提高C+M(-8)组的荧光信号强度(P0.05);而H组中,热应激使得线粒体染色强度明显降低(P0.05),而H+M(-8)组又显著提高了荧光信号强度(P0.05)。这说明褪黑素增加了卵母细胞中活性线粒体数量同时保持线粒体膜电位处于正常水平。在猪卵母细胞中与mt DNA复制相关的核编码基因的表达进行检测得出:与C组相比,C+M(-8)组能够显著提高Tfb1m基因的表达(P0.05)。而H组中,Tfb1m、POLG2的表达显著下降(P0.05),H+M(-8)组中Tfb1m、POLG2、POLG、Ssbp1的表达与H组相比都有显著的提高(P0.05)。这说明褪黑素是通过调节核编码线粒体相关基因的表达影响mt DNA拷贝数,从而提高卵母细胞的质量,以缓解热应激对其损伤。为进一步研究核编码基因与线粒体编码基因之间的关系,选取了线粒体基因ND2和ND6进行检测,结果表明:与C组相比,C+M(-8)组显著的提高了ND2和ND6基因的表达(P0.05),热应激显著的降低了ND2和ND6基因的表达(P0.05),但在H组和H+M(-8)组并没有显著变化(P0.05)。综上所述褪黑素在正常培养条件下提高线粒体基因的表达,进而增强氧化磷酸化为卵母细胞发育提供足量的ATP。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828

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