山羊高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ基因的克

发布时间：2018-04-01 16:16

  本文选题：高尔基体α-甘露糖苷酶II　切入点：山羊　出处：《西北农林科技大学》2015年硕士论文

【摘要】：高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidase,GMⅡ)是N-糖基化过程的一个关键酶。研究表明,GMⅡ被抑制后肿瘤细胞的生长和转移能力明显降低,GMⅡ抑制剂苦马豆素(swainsonine,SW)已被证实具有抗肿瘤效果,但SW可同时抑制溶酶体α-甘露糖苷酶导致溶酶体贮积症。因此,对GMⅡ进行特异性抑制成为抗肿瘤治疗的重要途径。研究GMⅡ结构可以充分理解其催化和抑制机制,为GMⅡ的特异性抑制提供分子和理论基础。目前,仅报道了果蝇GMⅡ的晶体结构,GMⅡ的基因序列仅从果蝇、鼠类、人、拟南芥属等种属中提取,其蛋白表达也局限于在细胞中进行。对哺乳动物GMⅡ的深入研究还尚未进行,这大大缩小了GMⅡ的抗肿瘤研究范围。本试验,以山羊为研究对象,通过反转录PCR技术获得山羊GMⅡ(chGMⅡ)的cDNA序列,利用毕赤酵母表达系统表达该蛋白,通过同源建模和分子对接等生物信息学技术对其空间结构和活性位点进行预测,为进一步对哺乳动物的抗肿瘤试验研究打下分子基础。试验结果如下:1.从山羊肝脏组织中提取出总量RNA,通过反转录PCR技术扩增出全长为3552 bp的chGMⅡ cDNA序列,并将此序列提交至GeneBank(KF717587)。对其进行生物信息学分析发现,该序列包括一个可编码1144个氨基酸的完整CDS区,蛋白分子量和理论等电点(pI)分别为130.589 kD和8.04,无信号肽序列,含一个跨膜结构域,其二级结构包括23.5%的α-螺旋、22.1%的β-折叠和54.4%的Loop结构。2.利用荧光定量PCR技术,获得chGMⅡ在心、肝、脾、肺、肾、卵巢、小肠7种不同组织中的相对表达量。结果表明,chGMⅡ在七种组织中均有表达,但在脾脏的表达量最高,肝脏、卵巢、肺脏、小肠次之,心脏和肾脏中表达量最低。3.利用SWISS-MODEL同源建模工具建立chGMⅡ的空间三维结构,经Procheck软件对其质量评估发现该结构的大多氨基酸均处于允许区域,建模质量良好。利用该结构分别与其特异性底物GnMan5Gn2和抑制剂SW进行分子对接。结果发现,由Zn原子、Asp178,His176,Asp290和His570残基构成的锥形立方体是chGMⅡ的活性中心。4.成功构建重组表达质粒pPICZαA-chGMⅡ并将其导入毕赤酵母X-33进行甲醇诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定,发现成功表达出分子量为130 kDa的chGMⅡ,且胞内表达量高于胞外,碱性条件下更适合其表达,且在pH8条件下表达产物最多。5.对纯化的chGMⅡ进行活性检测,测得其酶活力为149.38 U,最适温度42℃,pH5.4,Fe2+、Zn2+、Ca2+和Mn2+可促进其活性,而Cu2+、Co2+、EDTA可抑制其活性。
[Abstract]:Golgi 伪 -mannosidase 鈪，

本文编号：1696283