小反刍兽疫病毒（PPRV）血凝素（H）蛋白的线性B细胞表位作图
本文选题：小反刍兽疫病毒 切入点：H蛋白 出处：《上海海洋大学》2017年硕士论文
【摘要】：小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是一种急性的接触传播的传染病。致病原是小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)。血凝素蛋白(H蛋白)在PPRV侵染过程中负责与宿主细胞的受体结合,能够刺激机体产生保护性免疫。本研究采用改良的生物合成肽法,以抗重组PPRV H蛋白免疫兔血清为一抗,利用Western blot来开展PPRV H蛋白的线性B细胞表位作图研究。本文主要进行了以下研究:1.包含线性B细胞表位16肽片段的筛选首先,设计合成覆盖PPRV H蛋白序列全长的、相互重叠8个氨基酸残基的系列16肽编码DNA序列;在序列的5’端添加Bam H Ⅰ酶切位点序列,在序列的3’端添加TAA-Sal Ⅰ酶切位点序列;体外退火后连接至pXXGST-3原核表达载体,得到重组16肽表达载体pXXGST-3-P75-(1~75)。测序验证正确的重组质粒转化BL 21感受态细胞,SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗,利用Western blot筛选出阳性反应性的16肽片段,从75个GST融合表达的16肽中,获得了14个阳性反应性的16肽,分别为P1、P9、P10、P11、P13、P28、P45、P46、P47、P48、P58、P60、P63和P74。2.阳性16肽最小线性B细胞表位基序鉴定然后,设计合成覆盖各个阳性反应性的16肽序列全长的、相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA序列;在序列的5’端添加Bam H Ⅰ酶切位点序列,在序列的3’端添加TAA-Sal Ⅰ酶切位点序列;体外退火后连接至pXXGST-3原核表达载体,得到系列重组8肽表达载体。测序验证正确的重组质粒转化BL 21感受态细胞,SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗,利用Western blot鉴定阳性反应性的16肽的最小表位基序。结果表明除了对应于P13的系列8肽全部为阴性反应,其最小表位基序需要进一步确定外,在对应其它16肽的系列8肽中均筛选到1-6个阳性反应性的8肽。共得到12个最小的线性B细胞表位基序,分别为:~8INA10(in P1),~(73)RLNTNIKL~(80)(in P10),~(84)IDHQT88(in P11),~(224)EEGLFGRT~(231)(in P28),~(359)KDDEANW~(365)(in P45),~(367)VPSTDV~(372)(in P46),~(372)VRDLQ~(376)(in P47),~(383)VEACKTR~(389)(in P48),463FLGMINT470(in P58),~(478)VMPHILT484(in P60),~(504)VDDDIK~(509)(in P63)和~(590)TDEEVHT~(596)(in P74)。3.阳性16肽P13最小线性B细胞表位基序鉴定由于对应于阳性16肽P13蛋白的系列8肽的Western blot结果全为阴性,所以我们采用依次缩短肽法鉴定其最小表位基序。设计并合成从N-端和C-端依次减少1-7个氨基酸残基的系列15-9肽编码DNA序列,体外退火并连接至pXXGST-3原核表达载体,得到系列重组9-15肽表达载体。测序验证正确的重组质粒转化BL 21感受态细胞,SDS-PAGE筛选阳性克隆。以抗重组H蛋白免疫兔血清作为一抗,利用Western blot鉴定P13的最小表位基序。得到一个10肽的最小表位基序:~(98)ⅡGDEVGIRI~(107)。4.最小线性B细胞表位疫苗免疫羊血清抗体可及性验证以疫苗株PPRV 75/1免疫羊血清作为一抗,利用Western blot来验证获得的H蛋白的线性B细胞表位的最小表位基序的抗体可及性。结果表明获得的13个最小B细胞表位基序中,9个具有PPRV疫苗免疫羊血清反应性。5.PPRV H蛋白的线性B细胞最小表位基序的3D建模为了阐述识别的线性B细胞表位的13个最小表位基序在PPRV H蛋白上的空间位置,我们通过Phyre2服务器进行密集建模。预测结果表明,H蛋白头域的412个残基(约占89%)以大于90%的置信度建模。然而,胞尾和茎区没有一个残基的建模置信度大于90%。绘制的线性B细胞最小表位基序分布在预测环、β-折叠和螺旋的区域,并且鉴定的线性B细胞13个最小表位基序中的10个暴露在预测3D结构的表面,表明它们都可能是抗体可接近的线性B细胞表位基序,羊抗体鉴定结果也证明这10个暴露表位中有8个是抗体可及性的表位。其余3个线性B细胞表位基序几乎完全埋在PPRV H蛋白内,其中一个埋藏表位与羊血请抗体有弱阳性反应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
【参考文献】
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，本文编号：1699973
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