三株枯草芽孢杆菌体外降解饲料蛋白的差异及编码蛋白酶基因的分析

发布时间：2018-04-03 05:02

  本文选题：枯草芽孢杆菌　切入点：降解蛋白　出处：《四川农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：枯草芽孢杆菌是重要的益生菌饲料发酵剂菌种,而不同种动物肠道内枯草芽孢杆菌在降解饲料蛋白能力上的差异及编码降解蛋白酶基因有何特点,是值得深入研究的课题。它有助于我们了解枯草芽孢杆菌在不同动物肠道中的生长活力、蛋白酶活力和酶结构稳定性,这对开发应用于猪、禽和水产养殖的微生物制剂有着重要的意义。本研究选用从本实验室已分离筛选到的三株性状优良且不同来源的枯草芽孢杆菌(分别是鱼源A7株、猪源H6株和鸡源S1株)。通过单因子试验设计优化种子培养基,确定了A7株、H6株和S1株的最佳培养温度是28℃、37℃和39℃,以及最佳培养pH值是pH7.0、pH7.0和pH6.8。采用正交设计对菌株固体发酵培养基进行优化试验,确定了三株菌株的最佳固体发酵条件均为：装料量40g/250ml、接种量5%和固体发酵时间48h。在上述最佳固体发酵条件的基础上制作菌粉,A7株菌粉中活菌数可达8.90×109CFU/g,H6株可达5.60×1010CFU/g和S1株可达6.80×1010CFU/g,三种菌粉中芽孢率均在90%左右。菌株保存期内的复活试验结果显示,A7株在保存期内复活效果最好,H6株次之,S1株最差。A7菌株的复活率和芽孢率均较稳定,至保存期3月,A7株菌粉含菌量为6.34×109CFU/g,芽孢含量为5.13×1O9CFU/g,菌粉中芽孢率仍达到80%以上,芽孢复活率为78.86%,,且菌粉于4℃条件下保存比相同环境常温保存更稳定。菌株降解蛋白能力试验结果显示,A7株H6株S1株。H6株和S1株降解蛋白能力相似,且S1株降解酪蛋白能力最差。饲料样本经粗酶液酶解后,A7株试验组豆粕和玉米粉的降解率分别可达：53.13%和11.17%,比对照组提高了17.64%和7.49%；对豆粕和玉米粉的蛋白水解度(DH)为可达：28.06%和17.31%,比对照组提高了16.42%和8.44%。利用菌株的DNA为模板,成功扩增并测序出菌株的蛋白酶基因,测序结果显示该片段大小均为1579bp,与部分芽孢杆菌属间的中性蛋白酶基因序列同源性达99%以上。三菌株间核苷酸编码区序列相似性为99.30%,推到出的氨基酸相似性为99.47%。酶结构预测表明,三株菌株的中性蛋白酶均为分子量中等大小,性质稳定的α/β型蛋白。本研究表明,来源于鱼、猪和鸡的枯草芽孢杆菌在培养条件以及对饲料蛋白降解上有明显的差异。从编码蛋白酶基因的核酸序列及推出的氨基酸序列和酶分子大小看,三菌株之间蛋白酶基因序列同源性较高,均属于中性蛋白酶范畴,一级结构存在8个氨基酸位点差异,蛋白酶空间结构较为一致,然而从蛋白酶功能上看,A7株蛋白酶降解力远远高于H7和S1株。因此推测,导致三株菌在降解饲料蛋白能力的差异主要是因编码菌株蛋白酶的核酸序列的不同所致,由此推导出的这8个氨基酸差异位点正是影响酶功能的关键性位点。
[Abstract]:Bacillus subtilis is an important probiotic feed starter strain , and the difference of Bacillus subtilis in the ability of degrading feed protein and the characteristic of coding and degrading protease gene are important to us to understand the growth vigor , protease activity and enzyme structure stability of Bacillus subtilis in the intestinal tract of different animals . The best solid fermentation conditions were as follows : loading quantity 40g / 250 ml , inoculation quantity 5 % and solid fermentation time 48 h . The best solid fermentation conditions were as follows : loading quantity 40g / 250 ml , inoculation quantity 5 % and solid fermentation time 48 h . The growth rate and spore rate of the strain were 8.90 脳 10 9 CFU / g and 5.13 脳 10 9 CFU / g .
The protein hydrolysis degree ( DH ) of soybean meal and corn meal was 28.06 % and 17.31 % , which was 16.42 % and 8.44 % higher than that of control group .

【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816

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本文编号：1703710