鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步验证

发布时间：2018-04-03 06:05

本文选题：鹿结核病　切入点：野毒株　出处：《吉林农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：鹿结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病,该病程世界分布,严重威胁人类的健康和畜牧业的发展。随着鹿养殖数量的不断增加,饲养员因接触病畜而感染结核的病例也逐年攀升,因此,控制鹿结核病的蔓延不但有助于降低养鹿业的经济损失,也降低了饲养员的患病风险。目前,卡介苗(BCG)可以预防鹿结核病。动物接种BCG一段时间内结核菌素皮内试验结果呈假阳性,严重影响结核菌素的皮内试验检测结果。RD1区和RD5区均在结核分枝杆菌中存在,在卡介苗中缺失。有资料证实RD5区的Rv3117基因能够区分动物结核病是自然感染还是卡介苗免疫,且其敏感性和特异性均高于ESAT-6蛋白。本研究克隆、表达并纯化了Rv3117蛋白,诱导表达了实验室保存的RD-1区基因的重组表达质粒并对其进行纯化获得Rv3117、Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875、Rv3878、Rv3874-3875和Rv3872-3874-3875蛋白。利用ELISA方法综合评价各蛋白作为鹿结核病ELISA检测方法的候选抗原的敏感性和特异性,筛选出最优抗原Rv3872-3874-3875蛋白,建立一种能够鉴别鹿结核病野毒株感染与卡介苗免疫的方法,从而降低鹿结核病ELISA检测的假阳性。本研究主要包括以下几方面内容:(1)Rv3117基因的克隆与表达载体的构建以结核分枝杆菌标准菌H37Rv为模板,设计特异性引物,扩增只在结核分枝杆菌中存在,而在卡介苗中缺失的RD5区的基因Rv3117。将目的基因Rv3117与克隆载体pMD18-T连接,经鉴定结果显示已将Rv3117基因成功克隆至克隆载体上。将Rv3117基因片段连接至表达载体pGEX-4T-1上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛取阳性克隆。(2)结核分枝杆菌野毒株与卡介苗差异基因的诱导表达及纯化对前期制备的pGEX-4T-1-Rv3117的菌种进行诱导表达,用Western blot方法检验其是否具有结核分枝杆菌的反应原性。大量诱导表达Rv3117蛋白和实验室保存的结核分枝杆菌RD1区特异性基因的菌种。用亲和层析的方法对其进行纯化,并对纯化结果进行SDS-PAGE分析。(3)鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA检测方法最优抗原的筛选本试验制备兔人工感染结核分枝杆菌、卡介苗和副结核分枝杆菌的阳性血清,以差异基因蛋白为包被抗原,分别建立间接ELISA方法,比较各包被抗原建立的间接ELISA方法的重复性、敏感性和特异性。结果表明Rv3872-74-75蛋白具有较高的重复性、敏感性和特异性,可以区分野毒感染和卡介苗免疫,为后期建立鉴别鹿结核病野毒株与卡介苗免疫ELISA检测方法做准备。(4)鉴别鹿结核病野毒感染与卡介苗免疫间接ELISA方法的建立及初步应用建立检测鹿结核病的Rv3872-74-75-ELISA方法,并用PPD-ELISA作为对照。对采集的鹿血样进行批量检测,结果表明Rv3872-74-75-ELISA能够鉴别鹿结核病的野毒感染与卡介苗免疫,从而降低了接种卡介苗引起的假阳性结果。本研究利用分子生物学的方法,成功克隆并诱导表达结核分枝杆菌的差异基因蛋白,通过ELISA方法比较各蛋白作为包被抗原的优越性,最终确立Rv3872-74-75蛋白可作为包被抗原建立鉴别鹿结核病野毒株与卡介苗免疫ELISA检测方法,为鹿结核病的血清学诊断奠定基础。
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【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.25

【共引文献】