鸭肠炎病毒主要囊膜糖蛋白复合表位的制备及间接ELISA方法建立和初步应用

发布时间：2018-04-03 06:19

  本文选题：鸭肠炎病毒　切入点：糖蛋白B、C、D、E　出处：《东北农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis,DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的一种急性、热性、败血性高度传染性疾病,给水禽养殖造成巨大的经济损失。目前,常用的鸭病毒性肠炎抗体检测方法中,中和试验操作复杂,基于DEV的ELISA检测病毒纯化困难,成本较高,而以DEV某种囊膜糖蛋白抗原优势区建立的ELISA方法,检测的抗体单一,因此需要一种操作简单、成本低廉,且检出抗体全面的的检测方法。本研究旨在在筛选DEV囊膜蛋白B(g B)优势抗原区的基础上,结合本实验室已筛选的DEV g C、g D、g E的优势抗原表位,构建基于DEV主要囊膜糖蛋白抗原优势区的复合表位,建立检测DEV血清抗体的间接ELISA检测方法。为深入解析DEV g B的主要抗原结构及其特点,快速、简便、特异、准确的检测、监测DEV抗体水平提供理论依据和技术支持。本研究通过重叠表位作图法对DEV g B的B细胞线性表位进行筛选和鉴定,设计覆盖g B整个区域的多肽片段,利用大肠杆菌p ET-32a表达系统,实现了截短融合蛋白表达及纯化,并结合Western-blot筛选出DEV g B的优势抗原区,经四轮筛选成功鉴定的两个优势抗原区,分别位于N端111-150aa(ATDRPHGLMNDQDTHLDGERLIRGVQSTREI)和506-530aa(QELTRDNRTELALDLLG AMRGDKTR),是现已知被鉴定的最小的优势抗原区。本研究通过间接ELISA方法对DEV的g B、g C、g D、g E截短融合蛋白的抗原性测定,进一步符合Western-blot的鉴定结果,同时对g B、g C、g D、g E抗原性强弱比较分析。研究发现间接ELISA检测的结果与Western-blot基本吻合,且g B的抗原性最强,g C次之,g D稍弱,而g E最弱。本研究利用试验DEV免疫的各周鸭血清对g B、g C、g D、g E抗体消长规律进行测定,结果显示针对g B的抗体变化与针对DEV抗体基本一致,免疫后第一周即可检测到特异性抗体,第三周达到峰值,而针对g C、g D和g E的抗体水平基本保持同步,免疫后第一周也可检测到特异性抗体,第八周达到峰值。研究表明g B在免疫早期即表现出高的抗原性,而g C,g D、g E在免疫后期表现出高的抗原性,且g B抗原性明显高于g C、g D、g E。通过对g B、g C、g D、gE抗原性强弱的比较,选择抗原性最强的不同囊膜糖蛋白抗原优势区串联,设计合成了两段复合表位DEV-1-GP和DEV-2-GP,基因优化后以适应大肠杆菌表达系统,并利用同尾酶法反复串联1~7拷贝构建DEV-1、2-GP1~7,利用大肠杆菌p ET-30a表达系统,实现了融合蛋白表达及纯化,经Western-blot和间接ELISA鉴定DEV-2-GP2蛋白表达量高,抗原性强,且为上清表达,可作为诊断抗原。基于复合表位DEV-2-GP2的间接ELISA方法检测血清中DEV抗体水平,确定间接ELISA检测方法的临界值为0.35,用建立的ELISA检测方法对常见的几种鸭病阳性血清:鸭病毒性肝炎、鸭源小鹅瘟、鸭减蛋综合征、鸭源禽流感进行检测,结果均为阴性,表明该ELISA检测方法具有良好的特异性。最低检出量为1:320,表明该方法敏感性强,批内重复性试验变异系数在1.50%~8.12%,批间重复性试验变异系数在2.56%~8.89%,表明该方法具有良好的重复稳定性。与OIE推荐的DEV抗体检测中和试验相比,符合率为82.8%,与市售的商品化试剂盒相比,符合率为76.7%,利用本方法可很好地监测SPF鸭免疫鸭瘟弱毒疫苗的血清抗体变化,并对免疫鸭瘟弱毒疫苗的商品鸭及DEV免疫背景不清的现地鸭血清检测,阳性率分别为50%和4.2%。说明本方法可初步应用于鸭病毒性肠炎抗体的检测,为我国鸭肠炎病毒的检测和血清流行病学调查提供了有效的技术支持。
[Abstract]:Duck enteritis virus (duck viral, enteritis, DVE) by duck enteritis virus (Duck enteritis, virus, DEV) is an acute, heat caused by septic, highly contagious disease, causing huge economic losses to waterfowl breeding. At present, of duck enteritis virus antibody detection methods used in neutralization test complex detection of ELISA virus based on DEV purification difficult, high cost, ELISA method and DEV to a glycoprotein antigenic dominant region establishment, single antibody detection, so we need a simple operation, low cost, and the detection method for detecting antibody. The purpose of this study was to complete in the screening of DEV envelope protein B (g B) based dominant antigen regions, combined with the G C laboratory has screened DEV, G D, G E epitope construct composite table DEV glycoprotein antigen dominance region based on indirect ELIS, establish the detection of serum antibody against DEV A is the main antigen detection method. The structure and characteristics of DEV g B, in-depth analysis of the rapid, simple, specific, accurate detection, monitoring the antibody level of DEV and provide a theoretical basis and technical support. This study by overlapping epitope mapping method of DEV g B B cell linear epitopes were screened and identified, peptide design g B covering the entire region, the E.coli Expression System of P ET-32a, the truncated fusion protein expression and purification, and the combination of Western-blot DEV g were dominant antigen B, after four rounds of screening two dominant antigen regions successfully identified, respectively located in the N terminal 111-150aa (ATDRPHGLMNDQDTHLDGERLIRGVQSTREI) and 506-530aa (QELTRDNRTELALDLLG AMRGDKTR), is now known by the identification of minimal dominant antigen regions. This study by indirect ELISA method for DEV g B, G C, G D, G E truncated fusion protein antigenicity determination, in order to meet Western- blot鐨勯壌瀹氱粨鏋，

本文编号：1703974