奶山羊乳腺组织miRNAs的鉴定、筛选及功能的初步研究

发布时间：2018-04-04 07:22

  本文选题：奶山羊　切入点：乳腺组织　出处：《西北农林科技大学》2015年硕士论文

【摘要】：奶山羊(Capra hircus)是一种重要的经济物种,且山羊乳的营养成分及吸收效率均高于牛乳,因此适宜人们饮用并成为现代乳制品行业的一个重要原材料,由于山羊乳的特点和乳腺组织中的脂质代谢密切相关,因此对其乳腺组织的发育,泌乳及乳脂代谢进行研究是极其必要的。然而目前针对山羊乳脂代谢的研究还较少,且大多都集中于基因功能的探究与分析,缺乏从转录后水平,如microRNAs(miRNAs)水平对其进行研究。近年来,随着高通量测序技术以及生物信息学的发展,一系列的miRNAs被发掘并提交到miRBase中,然而,在miRBase 20.0数据库(2013年6月)中,还没有可以利用的山羊miRNAs序列,并且,在以往的研究中,由于没有可利用的山羊基因组,因此山羊的solexa测序结果一般是与其近缘物种,如牛,绵羊等的基因组相比对,来获得其miRNA转录组。在本研究中,通过将solexa测序结果与山羊的基因组进行比对,从而获得了更加可靠的山羊泌乳期miRNA转录组;通过对山羊miRNAs序列及其在山羊基因组上的定位分析,从而了解了山羊miRNA转录组特征;通过筛选并验证在不同泌乳时期差异表达的miRNAs,从而得到了一些可能对山羊乳腺发育,泌乳及乳脂代谢等具有重要的调控作用的miRNAs。主要结果如下:1、通过solexa测序技术,在山羊泌乳中期乳腺组织中共检测到了24479196个原始序列读数(raw data),经过一系列的质量过滤后,最终得到了21517296个clean reads,占raw data的87.9%。对clean reads进行长度分析后发现,clean reads的片段大小主要集中在21-23nt之间,且在22nt长度处具有最多的序列读数。将clean reads中相同的序列合并成一个unique reads,并与miRBase 20.0数据库中已注释的哺乳动物的pre-miRNAs,mature miRNAs以及山羊的基因组进行比对,最终得到了1059个mature miRNAs和821个pre-miRNAs,其中成熟的miRNAs包括796个保守的mi RNAs以及263个新的miRNAs。2、对测序得到的1059个miRNAs进行首位碱基的偏好性分析,结果显示miRNAs的首位碱基对U有强烈的倾向性,而对G则有一定的抗性。对796个保守的miRNAs进行序列分析,发现与已注释的序列相比,山羊miRNAs序列大多在其3'端发生了变化,由此形成了多个miRNA变异体(isomiR),且山羊miRNA转录组中的大部分miRNAs都是以isomiR的形式存在的。3、将796个保守的miRNAs与mi RBase 20.0数据库中的24种哺乳动物的miRNAs进行比对,结果发现与其他物种相比,山羊与牛具有相同miRNAs的数目最多,为404个,而山羊与绵羊具有同源miRNAs的数目则较少,仅为102个。4、将821个pre-miRNAs与山羊基因组的染色体序列进行比对,结果发现有796个pre-miRNAs可以比对到山羊的染色体序列上,对比对上的pre-miRNAs进行进一步的染色体密度分析,发现796个pre-miRNAs在山羊染色体上的分布密度在1.1-0.11/Mbp之间,其中9号染色体上pre-miRNA的密度最小,为0.11个/Mbp,而21号染色体上pre-miRNAs的密度最大,为1.1/Mbp。5、miRNAs在基因组上是成簇排列的,将基因间最大间距(maximum inter-distance,MID)分别定义为3Kb,5Kb,10Kb以及50Kb时对山羊的miRNA cluster进行统计,结果发现当MID为3Kb时,429个miRNAs形成了86个cluster;当MID为5Kb时,442个miRNAs形成了87个cluster;当MID为10Kb时,460个miRNAs可形成90个cluster;而当MID为50Kb时,501个miRNAs共形成了99个cluster。6、将种子序列完全相同的miRNAs定义为一个miRNA家族,对测序得到的1059个mi RNAs按其种子序列进行家族分析,结果发现,有479个miRNAs可以与其他miRNAs形成mi RNA家族,共形成了164个miRNA家族,其中最大的家族为包含有12个成员的let-7家族,而剩余的573个miRNAs由于不含有与其他miRNAs相同的种子序列,因此无法形成miRNA家族。7、通过对U2,18s rRNA,5s rRNA基因分别设计反转录及定量引物,并进行定量检测和扩增产物的鉴定,最终确定5s rRNA为miRNA S-Poly(T)法定量检测的内参。8、通过将本次测序结果与已报道的研究成果相比对,最终得到了37个在山羊乳腺组织不同泌乳时期差异表达的miRNAs,利用qPCR方法对这些miRNAs分别进行泌乳前期、泌乳盛期、泌乳中期以及干奶期的乳腺组织表达水平检测,发现仅有miR-222_R+2在四个不同的泌乳时期内没有明显的表达差异,而其余的36个miRNAs均存在着显著的差异表达。9、通过在山羊乳腺上皮细胞中过表达mi R-145,并对其进行油红O染色和甘油三酯含量的检测,发现其不仅能够显著增加细胞中脂滴的含量,而且能够促进细胞内甘油三酯含量的积累。结论:完成山羊泌乳期miRNA转录组的鉴定及特征分析,并筛选及初步验证了36个可能对山羊乳腺发育,泌乳及乳脂代谢等具有重要的调控作用的miRNAs。
[Abstract]:The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . With the development of high - throughput sequencing and bioinformatic development , there are 24479196 miRNA transcriptions in goat ' s breast tissue . In recent years , with high - throughput sequencing and bioinformatic development , a series of miRNA transcriptions have been obtained . In comparison with other species , we found that the first base pair U has a strong tendency towards U and has a certain resistance to G . It is found that when MID is 5 Kb , the number of pre - miRNA in the goat is smallest , which is only 102 . 4 . When MID is 10 Kb , there are 99 clusters . In the case of MID being 10 Kb , the number of the two hundred and ninety - nine microRNAs is defined as a miRNA family , and the 1059 mi RNAs obtained by sequencing are family analyzed according to their seed sequence , and the results are found . It was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells of goat mammary gland , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and to find out that only miR - 222 _ R + 2 had important regulatory effects on mammary gland development , lactation and milk fat metabolism .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S827

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本文编号：1708941