鸽源禽毛滴虫G3蛋白克

发布时间：2018-04-04 10:12

本文选题：鸽源禽毛滴虫　切入点：G3蛋白　出处：《山东农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：鸽源禽毛滴虫又称鸽毛滴虫,属鞭毛虫纲、毛滴虫科、毛滴虫属,其嗜好寄生部位是鸽消化道前段,引起各种消化道症状,导致鸽毛滴虫病,本病没有季节性,宿主对本病的敏感性没有品种和日龄的差别,其中幼鸽对本病最为敏感,成年鸽抵抗力强,常呈无症状的隐性感染。虫体寄生于粘膜上皮细胞间隙处,发病时表现为一层坏死性溃疡覆盖于口腔、食道、嗉囊、胃部粘膜之上,症状严重时粘膜外覆盖黄色粗糙的干酪样渗出物,导致患鸽呼吸和采食困难,口腔分泌物增多,眼观症状比较直观的是胸部羽毛脏乱,症状进一步发展会造成宿主死亡。目前治疗本病常采用化学药物,药物对动物容易产生副作用,且抗药虫株很容易被药物的选择压力下诱导产生。有必要深入了解疫苗相关蛋白分子,开发安全有效的防治方法。G3蛋白有多个开放阅读框,具有良好的免疫原性,本研究将新型蛋白进行克隆表达,鉴定其免疫原性,评估其开发新型疫苗的可能性,为防控鸽毛滴虫病提供新途径。主要研究内容与结果如下:1.鸽源禽毛滴虫G3(TgG3)蛋白的克隆及测序根据已上传的阴道毛滴虫G3(TvG3)蛋白部分基因序列ORF设计引物,提取鸽源禽毛滴虫总RNA,反转录,经PCR扩增获得TgG3蛋白基因序列。经TA克隆至pJET 1.2克隆质粒里,经生工测序,TgG3蛋白的ORF包含碱基序列1623bp,编码540个氨基酸,蛋白质理论分子量为63.7千道尔顿。2.鸽源禽毛滴虫G3(TgG3)蛋白的序列及生物信息学分析比对鸽源禽毛滴虫G3(TgG3)蛋白与阴道毛滴虫G3(TvG3)蛋白的碱基序列,两者碱基同源性为78%,从5’端到3’端差异均匀分布,每隔几个碱基就有差异出现,未检索到TgG3碱基序列与其他蛋白有很大同源性。经氨基酸序列比对,鸽源禽毛滴虫G3(TgG3)蛋白与阴道毛滴虫G3(TvG3)蛋白氨基酸同源性达98%,氨基酸序列有9处不同。该蛋白与胎儿三毛滴虫TRFO_13881蛋白氨基酸同源性达83%。使用生物信息学软件对鸽源禽毛滴虫G3(TgG3)蛋白氨基酸序列进行分析预测,显示TgG3蛋白无前导肽和信号肽、有亲水性、为碱性氨基酸、无GPI,有SMC结构域。3.鸽源禽毛滴虫G3重组蛋白多克隆抗体的制备采用同源重组法,用CloneEZ PCR克隆试剂盒构建重组质粒pET28a-G3,将重组阳性质粒转化至E.coli transetta中,IPTG诱导表达,将菌体超声破碎,取包涵体用尿素溶解、经Ni柱纯化。SDS-PAGE电泳显示,原核表达的重组蛋白大小约为63.7KDa,与软件预计的分子量大小相符。将纯化后的原核表达鸽源禽毛滴虫G3蛋白加佐剂免疫小鼠,制备多克隆抗体高免血清,用间接ELISA法检测血清抗体效价。采用Westerm-blot鉴定分析G3重组蛋白的抗原性,制备的小鼠多抗能够识别pET28a-G3原核表达的重组蛋白,原核表达的重组蛋白具有良好的抗原性。4.多抗与虫体天然蛋白反应性检测取对数生长期的虫体裂解经蛋白质电泳,用抗G3蛋白小鼠多抗进行Western-blot,结果显示,鸽源禽毛滴虫虫体中有分子量为63kDa左右的蛋白能够被抗G3蛋白小鼠多抗识别,说明原核表达的G3重组蛋白有良好的免疫原性。本试验经PCR扩增获得鸽源禽毛滴虫G3蛋白碱基序列,构建了原核表达重组质粒pET28a-G3并用transetta表达出分子量为63.7kDa的重组蛋白,免疫小鼠制备的多抗能够识别原核表达的重组蛋白,说明重组蛋白抗原性良好。多抗与虫体蛋白反应性良好,说明重组蛋白的免疫原性良好。
[Abstract]:In this study , the sequence of TgG3 ( TgG3 ) protein was cloned and sequenced . The results were as follows : 1 . The gene sequence of TgG3 protein was 1623bp . The recombinant plasmid pET28a - G3 was prepared by using CloneEZ PCR cloning kit . The recombinant plasmid pET28a - G3 was prepared by Western - blot .

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.39

【参考文献】