猪流行性腹泻病毒变异株N蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立与应用

发布时间：2018-04-08 23:34

本文选题：猪流行性腹泻　切入点：N基因　出处：《南京农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：猪流行性腹泻病(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一种猪的消化道疾病,导致感染猪腹泻、呕吐,甚至脱水死亡,对仔猪影响极大,感染后死亡率接近100%。猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是该病的病原,属于冠状病毒,是一种单股正链RNA病毒,易变异,难以防控。该病1971年首次被发现,之后一直存在于欧洲、亚洲等地的猪群中,但没有大的爆发,2010年我国出现了 PEDV变异毒株,并迅速传播蔓延,对我国养猪业造成了巨大损失。2013年,该病传播至美国,同样迅速席卷美国各地猪场,至今已蔓延至美洲许多国家。2014年底至2015年初,欧洲部分猪场也出现了该疾病的报道,病情仍在不断扩大。除了对养猪业造成巨大损失外,目前对冠状病毒的研究表明,该病毒发生的变异,可能会导致其宿主细胞嗜性发生变化,即有可能发生变异后感染人类,2003年我国爆发的重急性呼吸系统综合征(SARS),同属于冠状病毒,SARS造成的损失至今仍记忆犹新,我们应以此为鉴,对PEDV进行严格的防控,防止其对人类健康造成威胁。传染病的防控中,对病原感染的早期准确诊断是及其重要的一环。目前对PEDV的诊断主要依靠RT-PCR方法,该方法操作繁琐,依赖设备,养殖场与基层兽医没有条件进行检测。而ELISA方法则操作简便,没有条件限制,能够迅速进行检测。利用重组PEDV抗原蛋白建立的间接ELISA方法,能够对猪血清PEDV抗体水平进行检测,该指标对疫苗免疫效果的评价也具有指导意义。母猪初乳中的母源抗体是断奶前仔猪抵抗PEDV感染的重要免疫保护力来源,间接ELISA方法还可以对乳汁IgA抗体水平进行检测,对仔猪免疫力的评价也具有指导意义。PEDV核衣壳蛋白(N蛋白)是一种重要的病毒抗原,感染机体后表达量大,感染早期即可检测到PEDV N蛋白抗体,该抗原是建立间接ELISA方法的理想抗原。因此,本研究内容主要包括如下2方面:1.对国内流行的PEDV毒株N基因序列进行分析,选择了具有代表性的毒株AH2012,以其N基因序列为模板,构建了原核表达载体pET-28a-N,成功表达出重组PEDV N蛋白,经蛋白免疫印迹试验验证,该蛋白免疫原性良好。而且该蛋白在低温诱导时为可溶性表达,能够在实验室内大量制备并进行纯化,为后续ELISA方法的建立与应用打下了良好基础。2.使用该重组N蛋白建立了抗体检测间接ELISA方法,并对各步骤进行了优化。该方法检测结果稳定可靠,环境、温度等条件影响小,灵敏度高,特异性良好,不与其他常见猪病阳性血清发生反应。同病毒中和试验结果对比,各份检测血清的中和抗体水平与N蛋白抗体水平符合率为96.3%。使用市售PEDV疫苗免疫仔猪,采血后使用该ELISA方法检测仔猪血清抗体效价,结果可见二免后1个月内,抗体效价检测值即可达到1:6400以上,且抗体水平消长变化符合自然免疫规律。随后组装并试制了 PEDV抗体检测用间接ELISA试剂盒,该试剂盒检测临床血清时,同中和试验相比,阳性符合率为90.77%;阴性符合率为80.0%。两种检测方法符合率良好。同时该试剂盒在2～8℃下,能够保存至少9个月。该N蛋白间接ELISA方法可以应用于我国PEDV流行变异毒株的诊断、流行病监测以及疫苗研发时的抗体水平检测。后续还将对该N蛋白抗原检测初乳IgA抗体的ELISA方法进行研究。为PEDV的防控提供一种有效的实用工具。
[Abstract]:Porcine epidemic diarrhea virus ( PED ) is a kind of pig ' s digestive tract disease , which leads to diarrhea , vomiting and even dehydration death of pigs . It has been found in the swine herds in Europe , Asia and so on . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . An indirect ELISA kit for the detection of anti - PEDV antibody against PEDV was established .

【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

【参考文献】