抗猪氨基肽酶单克隆抗体的制备及阻断氨基肽酶受体功能的分析

发布时间：2018-04-09 17:58

本文选题：猪流行性腹泻病毒　切入点：猪传染性胃肠炎病毒　出处：《东北农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)这使两种病毒是哺乳仔猪高致死率的主要原因,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。如何有效防治这两种疾病是当前亟待解决的问题,而对相关致病机理的研究可为有效防治提供理论依据。猪氨基肽酶(porcine aminopeptidase N,p APN)是一类锌离子依赖性的膜结合II型金属糖蛋白,存在于细胞表面,广泛分布于哺乳动物的多种组织细胞的表面,在中枢神经系统的突触膜、粒细胞和单核细胞、肾近曲小管上皮和肺脏细胞表面都有高水平的表达,尤其在小肠微绒毛表面大量存在,主要功能是水解肽、酰胺等结构中的酰胺键,从而释放出不同的N-中性氨基酸。APN作用的天然底物包括血管作用肽、神经肽激素、细胞因子和免疫调节剂等,因此它能参与很多重要过程的深度反应。研究发现,PEDV和TGEV均以pAPN作为细胞感染受体,同时p APN的抗体可以有效阻断p APN与PEDV和TGEV的结合。因此,制备抗p APN抗体及对其生物学特性的分析可以为有效防治PED和TGE提供理论依据和试验数据。本研究以天然p APN蛋白免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行融合,通过间接ELISA方法筛选,最终获得2株抗p APN的杂交瘤细胞系(命名为3E5和2E3),这两株细胞分泌的抗体亚类分别为IgG1和IgM,效价分别为1:1000和1:500。通过Western blot证实3E5株和2E3株分泌的抗体是针对p APN的SPC段(p APN 500aa-963aa段),且与天然p APN可发生特异性结合,免疫荧光实验证实3E5株和2E3分泌的抗体可以与IEC-2细胞和PK-15细胞上的天然p APN蛋白发生特异性结合。将抗p APN的单克隆抗体与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再分别感染PEDV和TGEV,于接毒后24h、48h、72h在显微镜下观察病变效果,结果表明,抗p APN的单抗可有效阻断p APN受体,且IEC-2细胞和PK-15细胞病变均被不同程度的抑制。进一步收取吸附后、病毒感染24h和病毒感染48h的细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,并对这三组样品进行显著性分析。结果表明,经p APN单克隆抗体作用后,细胞感染物中的病毒拷贝数显著降低,表明抗p APN单抗有效地阻断了p APN受体与病毒的结合,并进一步抑制了病毒的繁殖。将p APN单克隆抗体分别做1:10、1:100和1:1000倍稀释,将不同稀释度的p APN单抗分别与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再接种PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,检测分析不同浓度p APN单抗对p APN受体的阻断作用。结果表明,不同浓度的pAPN单抗都具有阻断p APN受体,抑制p APN受体与病毒结合,从而抑制病毒在细胞中的吸附的能力,且随着单抗浓度的降低阻断作用也随之降低。此外,将抗p APN的单克隆抗体与IEC-2细胞和PK-15细胞作用后,再分别感染不同拷贝数的PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取细胞感染物,提取RNA,通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数,检测分析p APN单抗对p APN受体阻断后对不同浓度病毒增殖的抑制作用。结果表明,p APN单抗对不同浓度的病毒都具有阻断作用,且不同浓度病毒组p APN单抗对p APN受体的阻断作用并无明显差异。以上结果证明,3E5株和2E3株分泌的抗体对p APN具有较高的特异性和亲和性,3E5株可有效阻断p APN受体与TGEV的结合,并抑制TGEV在细胞中的感染和增殖,为进一步设计抗病毒药物、封闭病毒受体、阻止病毒感染等研究奠定基础。
[Abstract]:It is found that both PEDV and TGEV can effectively prevent and control the binding of p APN to PEDV and TGEV . The effects of p APN monoclonal antibodies against p APN receptors on p APN receptors were investigated . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a blocking effect on p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a blocking effect on p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a high specificity and affinity for p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a high specificity and affinity for p APN . and can inhibit the infection and proliferation of TGEV in cells , and lays a foundation for further designing antiviral drugs , blocking virus receptors , preventing virus infection , and the like .

【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

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