Hep介导禽致病性大肠杆菌CE129病原性的研究

发布时间：2018-04-10 04:35

  本文选题：禽致病性大肠杆菌CEl29　切入点：Ⅵ型分泌系统　出处：《扬州大学》2015年硕士论文

【摘要】：禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是养禽业最严重的传染病之一,给养禽业造成了巨大经济损失,至今尚无有效的防治措施。禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli, APEC)分离株众多,其详细致病机理还有待深入研究,但是已经证实众多的毒力基因是其主要致病因子。Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system, T6SS)是一种新型分泌系统,Hcp管道是其主要结构,在细菌致病过程中扮演重要角色。本研究以Hcp主要亚单位hcp1和hcp2基因为切入点,探讨其在APEC CE129菌株感染宿主过程中的病原性。试验通过比对NCBI上hcp1、hcp2基因的已知序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除。首先各设计一对引物用于检测实验菌株APEC CE129是否含有hcp1和hcp2基因,引物分别与GeneBank中已知的hcp1和hcp2基因序列5’端同源。然后根据试验菌株的hcp1和hcp2基因再各设计一对引物,其5’端分别与hcp1和hcp2基因序列两侧同源,而3’端则与质粒pKD3的氯霉素抗性基因Cat同源,用于获得带氯霉素抗性基因的PCR产物,纯化后导入含有质粒pKD46的APEC CE129菌株中,在Red重组酶Beta、Exo、Gam作用下,氯霉素抗性基因片段依靠两侧同源序列与细菌染色体的靶基因发生重组,将hcp1和hcp2基因置换下来,通过氯霉素抗性平板筛选获得阳性克隆,即完成一次重组。再电转化导入编码F1p重组酶的质粒pCP20,通过对Cat两侧Flp位点的识别,消除抗性基因,即完成二次重组。最后通过PCR特异性检测和测序结果,验证缺失株CE129Δhcp1、CE129Δhcp2和CE129Δhcp1Δhcp2的成功构建。体外竞争试验结果表明,Δhcp1缺失株在与野生株的竞争中处于微弱劣势,其毒力被轻度弱化。血清杀菌试验结果显示,相比野生株CE129,缺失株CE129 Δhcp1、CE129Δhcp2、CE129Δhcp1Δhcp1抵抗血清补体杀菌的能力分别下降32.7%、35.1%和50.6%(p0.01)。生物膜定性定量试验结果表明,Δhcp2缺失株形成生物膜能力下降40%(p0.01),回补株上升至87%。DF1细胞黏附试验结果表明,Δhcp2缺失株的黏附能力下降46%(p0.01),回补株上升至96%。鸡胚体内感染试验结果显示,Δhcpi和Δhcp2单缺失株在鸡胚体内的增殖水平约为野生株的’/3,Δhcp1Δhcp2双缺失株约为野生株的1/2。Real Time PCR定量试验结果显示,hcp1和hcp2基因具有协同表达关系；相比野生株CE129,缺失株CE129Δhcp1对群体感应luxS、lsrR、pfs基因表达量分别下降29%、41%、33%(p0.05),hcp1回补株分别上升至85%、98%、96%,对抗血清存活因子ompA和iss基因表达量分别下调29%和24%(p0.05),回补株分别上升至109%和105%；缺失株CE129Δhcp2对菌毛fimA基因表达量下调47%(p0.01),hcp2回补株上升至88%,对黏附相关基因fimC和papC基因表达量分别下降60%和37%(p0.01),回补株分别上升至84%和96%,对抗血清存活因子ompA和iss基因表达量分别下调31%和41%(p0.05),回补株分别上升至109%和88%。综上所述,CE129的hcp2基因在细菌黏附,生物膜形成和血清杀菌过程中扮演重要角色,而hcpl基因在细菌体外竞争,群体感应和抗补体存活方面发挥作用,证明了Hcp直接与间接的介导了APEC CE129对宿主的致病过程。
[Abstract]:Avian colibacillosis (Avian Colibacillosis) is one of the most serious infectious diseases of poultry, poultry industry has caused tremendous economic losses, there is no effective control measures of avian pathogenic Escherichia coli (Avian Pathogenic, E.coli, APEC) isolated from many details, detailed disease mechanism needs further research, but has confirmed the virulence gene many is the main pathogenic factor. The type VI secretion system (type VI secretion system, T6SS) is a new type Hcp secretion system of pipeline is the main structure, play an important role in bacterial pathogenesis. In this study, Hcp subunit Hcp1 and hcp2 genes as the breakthrough point, to explore its pathogenic host process in the APEC CE129 strain infection. Through the comparison test on NCBI Hcp1, a known sequence of hcp2 gene, using phage lambda Red homologous recombination system of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains CE129 The type VI secretion system (T6SS) Hcp1 and hcp2 gene knockout. The design of a first primer for detecting whether the experimental strain APEC CE129 containing Hcp1 and hcp2 genes, primers and GeneBank respectively in the known Hcp1 and hcp2 gene sequences of the 5 'end. Then according to the homologous Hcp1 and hcp2 genes and the design of a test. On the 5' end of primers, respectively with Hcp1 and hcp2 gene sequence homologous, and the 3 'end of chloramphenicol resistance gene Cat and plasmid pKD3 homologous for PCR products with chloramphenicol resistance gene, purified into APEC containing plasmid pKD46 CE129 strain in Red, Beta Exo, Gam recombinase, role next, chloramphenicol resistance gene fragment of target gene homologous sequences and rely on the bacterial chromosome recombination occurs, the Hcp1 and hcp2 gene replacement down by chloramphenicol resistant plate screening positive clones, namely complete a restructuring.. The plasmid pCP20 was transformed into F1p encoding the recombinant enzyme, through identification of Cat on both sides of the Flp locus and eliminate resistance genes, to complete the two reorganization. Finally, the specificity of PCR detection and sequencing results verified the mutant strain CE129 CE129 Delta Hcp1, Delta hcp2 and delta Hcp1 Delta CE129 hcp2 was successfully constructed. The test results show that in vitro competition Delta, Hcp1 mutant and wild-type strain in the competition in the weak disadvantage, its virulence was slightly weakened. Serum bactericidal test results show that, compared to the wild strain CE129 and mutant CE129 CE129 Delta Hcp1, Delta hcp2, Delta Hcp1 Delta Hcp1 resistance ability of CE129 serum complement sterilization were decreased by 32.7%, 35.1% and 50.6% (P0.01) the biofilm qualitative and quantitative test results show that a hcp2 mutant biofilm formation ability decreased by 40% (P0.01), covering the line up to 87%.DF1 cell adhesion test results show that the adhesion of delta hcp2 mutant decreased 46% (P0.01), covering the line up to 96%. chicken embryos infection experiments showed that the proliferation level of /3 in chicken embryos was about wild strains' Delta hcpi and delta hcp2 deletion mutant, Delta Hcp1 Delta hcp2 double mutant is about 1/2.Real Time PCR quantitative test results of wild strains, Hcp1 and hcp2 genes expression has a synergistic relationship; compared to the wild strain CE129. The mutant strain CE129 of quorumsensing Delta Hcp1 luxS, lsrR, PFS gene expression was decreased by 29%, 41%, 33% (P0.05), Hcp1 covering strains were increased to 85%, 98%, 96%, ompA and ISS against serum survival factor gene expression were reduced by 29% and 24% (P0.05), covering strains were increased between 109% and 105%; the mutant strain CE129 of delta hcp2 pili fimA gene expression (P0.01), 47% hcp2 strains covering up to 88%, on the adhesion of the gene expression of fimC and papC genes were decreased by 60% and 37% (P0.01), covering strains were increased to 84% and 96%, against the survival factor OMP serum A and ISS gene expression were reduced by 31% and 41% (P0.05), covering strains were increased to 109% and 88%. in CE129, hcp2 gene plays an important role in bacterial adhesion, biofilm formation and serum bactericidal process, while HCPL gene competition in bacteria in vitro, play a role in survival and anti complement quorumsensing. That Hcp directly or indirectly mediated by the pathogenic process of APEC CE129 on the host.

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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本文编号：1729717