瘤胃上皮挥发性脂肪酸吸收与生物钟因子表达关系的研究

发布时间：2018-04-10 19:55

本文选题：瘤胃上皮细胞 + 生物钟基因　；参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：生物钟基因广泛存在于哺乳动物的细胞中,胃肠道内也存在生物钟基因的表达,且能够影响胃肠道内营养物质的吸收转运、以及转运蛋白的表达。本课题组前期研究发现,不同周龄湖羊瘤胃上皮组织的生物钟基因均能够表达。挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)作为瘤胃内发酵的主要产物和反刍动物的主要能量来源,且VFA能通过转运蛋白以吸收进入瘤胃上皮细胞。为此,本论文旨在初步探讨在瘤胃上皮细胞的挥发性脂肪酸吸收与其生物钟因子表达的关系。研究主要包括以下部分:试验一、山羊瘤胃上皮原代细胞的分离培养与生物钟蛋白的免疫荧光鉴定试验通过连续0.25%胰蛋白酶消化法分离瘤胃上皮原代细胞,并使用显微镜观察细胞形态、免疫荧光法鉴定细胞角蛋白18的表达、CCK8法(Cellcounting8)测定细胞活性,体外添加15mmol/L 丁酸钠测定瘤胃上皮细胞代谢丁酸的生物功能。同时,使用免疫荧光法鉴定山羊瘤胃上皮细胞的CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白的表达。分析结果:原代培养的瘤胃上皮细胞形态学上呈铺路石状分布,细胞生长曲线呈“S”型,符合上皮细胞的典型的形态和生长曲线。同时,细胞能够阳性表达细胞角蛋白18,使用含有15mmol/L的丁酸钠的培养液培养24h能够极显著提高培养液中β-羟丁酸的产量(P0.01),符合瘤胃上皮细胞的生物学功能,且体外瘤胃上皮细胞能够阳性表达CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白,存在生物钟蛋白的表达。试验二、不同挥发性脂肪酸对瘤胃上皮细胞增殖活性和吸收速率的影响试验通过体外添加15 mmol/LVFA处理瘤胃上皮细胞包括乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠处理细胞6、12、24h,使用CCK8法测定各组细胞活力,并且使用液相色谱仪测定培养液中的VFA浓度。VFA处理24h后使用流式细胞术测定细胞周期,同时,使用RT-PCR法测定细胞周期基因的表达。结果发现:1)对照组的细胞活力显著或极显著高于VFA处理组(P0.05或P0.01)。丙酸组的细胞活力在12h和24h极显著高于乙酸组和丁酸组(P0.01)。2)通过细胞周期的分析,VFA处理组的细胞处在G1期的比例极显著高于对照组,且乙酸组和丁酸组极显著高于丙酸组(P0.01)。3)细胞处理24 h后,处理液中丙酸组的丙酮酸浓度极显著高于其他组(P0.01),丁酸组极显著高于对照组和乙酸组(P0.01)。4)相比于对照组,VFA处理极显著的抑制CCND1、CCNB1和CDK1和CDK2的相对表达(P0.01),且能够下调CDK4的表达,但是差异不显著(P0.05)。5)不同VFA的吸收速率丁酸组最高,丙酸组次之,乙酸组最慢((P0.01),且培养液中的VFA浓度随着培养时间的延长而极显著下降(P0.01)。试验三、瘤胃上皮细胞挥发性脂肪酸吸收蛋白和生物钟因子表达的相关性研究试验通过体外添加15 mmol/LVFA处理瘤胃上皮细胞包括乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠处理细胞6 h、12 h、24h,研究不同VFA对细胞生物钟和VFA吸收基因表达、以及基因表达的相关性的影响。基因相对表达量通过RT-PCR法测定,基因表达量的相关性分析使用皮尔森相关分析进行。结果发现:1)VFA对于瘤胃上皮细胞生物钟基因和吸收基因表达有不同程度的影响,VFA处理极显著抑制Clock基因表达、而极显著提高Bmal1基因和Per2基因的表达(P0.01),丁酸组的Per3基因极显著高于其他组(P0.01)。丙酸组和丁酸组的Cry2极显著高于对照组和乙酸组(P0.01)。VFA能够显著提高NR1D1和RORa的基因表达,降低NR2F2、FBXW11的相对表达(P0.05),而对NCOR1没有显著影响(P0.05)。2)VFA处理对PPAR家族的基因表达存在不同的影响,丙酸组和丁酸组能够极显著上调PPARA的表达(P0.01),丙酸组的PPARD和PPARG的表达量显著高于对照组(P0.05)。3)VFA处理能够极显著提高PAT1,降低MCT1和MCT4基因的表达(P0.01),而对NHE1没有显著的影响(P0.05)。此外,不同VFA对于AE2、VH+ATPase的表达影响不一致。4)MCT1和MCT4基因表达与生物钟因子存在极显著的相关性(P0.01),Bmal1和PAT1的表达显著相关(P0.05)。且生物钟因子的表达与CCND1、CCNB1、CDK1和CDK2存在显著的正相关或者负相关(P0.05)。综上,1)使用0.25%胰蛋白酶连续消化、培养的瘤胃上皮细胞符合上皮细胞的形态、免疫化学、增殖活性的特点、并且具有相关的生物学功能,证明该细胞为山羊瘤胃上皮细胞。且瘤胃上皮细胞在体外能够阳性表达CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白。2)VFA能够通过下调细胞周期蛋白以及CDK的基因表达,影响细胞G0/G1期向S期转变,从而抑制瘤胃上皮细胞DNA合成、并降低细胞增殖活力。不同VFA在体外吸收速率存在差异。3)VFA对瘤胃上皮细胞的生物钟基因和吸收基因有不同程度的影响,生物钟基因的表达与细胞周期基因以及VFA吸收基因的表达存在相关性。
[Abstract]:In this paper , we studied the expression of biological clock gene in rumen epithelial cells by continuous 0.25 % trypsin digestion method . The results showed that : 1 ) The cell viability of rumen epithelial cells was significantly higher than that in VFA group ( P0.05 or P0.01 ) . Conclusion : 1 ) VFA can significantly increase the expression of the gene of the cell cycle protein and the expression of the gene , but also significantly improve the expression of the expression of the gene and the expression of the gene in the control group ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.2

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