鸡毒支原体脂质相关膜蛋白和GroEL蛋白诱导DF-1细胞释放IL-1β的研究

发布时间：2018-04-10 21:35

本文选题：鸡毒支原体 + 脂质相关膜蛋白(LAMPs)　；参考：《东北农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,M.gallisepticum)属于支原体属,能够引起鸡慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)、气囊炎和气管炎。鸡毒支原体能够黏附到宿主表面,激活宿主体内相关信号通路,造成宿主细胞损伤或凋亡。鸡毒支原体无细胞膜,但其表面存在着大量脂质相关膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。许多研究表明,LAMPs可以黏附到宿主细胞表面,激活宿主的天然免疫应答,但是LAMPs如何激活宿主天然免疫应答的具体机制尚未报道。病原微生物入侵到动物体内时,动物体首先启动天然免疫反应,产生天然免疫应答,进而释放相关炎症因子起到抗感染的作用。在天然免疫应答的研究中,NF-κB信号通路研究的最为广泛,存在于动物细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)在此过程中起到识别作用。TLRs家族成员众多,各自能够特异性识别配体,如TLR2和TLR4可以识别革兰氏阳性菌表面的脂蛋白,激活下游信号分子,启动数种信号通路并释放相应的细胞因子,造成宿主细胞的损伤或凋亡。由于支原体LAMPs在结构上与革兰氏阳性菌表面的脂蛋白相似,所以本实验旨在研究感染鸡毒支原体后是否能够激活NF-κB信号通路并引起IL-1β的释放,并且验证TLR2和My D88在此过程中的作用。鸡毒支原体LAMPs为混合物,其中含有的许多膜蛋白具有较高免疫原性,但其中何种蛋白能够激活鸡的天然免疫应答目前尚未明确。在大肠杆菌的相关研究中证实,Gro EL有较好的免疫原性。因此,研究鸡毒支原体Gro EL是否具有同样的高免疫活性,是否可以激活鸡的天然免疫应答对鸡毒支原体致病机制的研究具有重要意义。为研究鸡毒支原体LAMPs和Gro EL诱导DF-1细胞IL-1β释放的机制,本研究以鸡成纤维细胞(DF-1)为细胞模型,首先利用SYBR Green I Real-time PCR和ELISA方法检测LAMPs及Gro EL蛋白刺激后的DF-1细胞中IL-1β的释放量。结果表明:鸡毒支原体的LAMPs及Gro EL均能有效诱导DF-1细胞释放IL-1β,且IL-1β的释放量呈时间和剂量梯度。为了检测NF-κB信号通路是否被激活,本研究采用激光共聚焦检测p65入核和Western blot技术检测p65磷酸化水平。结果显示:鸡毒支原体LAMPs能够有效诱导DF-1细胞p65进核,并且鸡毒支原体LAMPs和Gro EL均能使p65磷酸化水平提高,从而确定鸡毒支原体LAMPs和Gro EL均能够激活NF-κB信号通路。为明确My D88和TLR2在此过程中的作用,采用质粒转染,抗体封闭方法使My D88和TLR2过表达或沉默,检测两种情况下IL-1β表达情况。经检测显示:过表达My D88、TLR2组的IL-1βmRNA和蛋白水平显著升高,而抗体封闭TLR2组和My D88沉默组的IL-1βmRNA和蛋白水平下降。证实LAMPs能够与DF-1细胞膜上的TLR2受体结合,并激活下游接头分子My D88,从而有效诱导DF-1细胞表达并分泌IL-1β。Gro EL蛋白在大肠杆菌中具有较高的免疫原性,为了证明其在鸡毒支原体激活宿主天然免疫应答中的作用,本研究采用激光共聚焦检测其黏附作用。结果表明:Gro EL蛋白可以成功的黏附到DF-1细胞表面,这为Gro EL蛋白发挥作用提供了基础。为了确定鸡毒支原体Gro EL激活宿主天然免疫的机制,本研究采用蛋白互作技术手段,即GST pulldown和免疫共沉淀,明确其在DF-1细胞中的互作蛋白。结果显示:Gro EL蛋白能够与DF-1细胞中的Annexin A2蛋白相互作用,为后期Gro EL致病机制的研究提供了重要的实验依据,也为鸡毒支原体的致病机制提供了理论基础。
[Abstract]:Mycoplasma gallisepticum ( M . gallisepticum ) belongs to the genus Mycoplasma and can cause chronic respiratory disease ( CRD ) , balloon inflammation and tracheitis . Mycoplasma gallisepticum can adhere to the host surface , activate relevant signal pathways in the host , and cause injury or apoptosis of host cells . There is a large number of lipid - associated membrane proteins ( LAMPs ) on the surface of Mycoplasma gallisepticum . In order to study whether mycoplasmal LAMPs can activate NF - 魏B signaling pathway and induce IL - 1尾 release , it is important to study whether mycoplasmal - like receptors ( TLR2 and Gro EL ) can activate NF - 魏B signaling pathway and release corresponding cytokines . The results showed that Gro EL protein could be successfully adhered to the surface of DF - 1 cells .

【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.62

【参考文献】