稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建及其应用

发布时间：2018-04-11 23:26

本文选题：猪繁殖与呼吸综合征病毒 + 病毒受体　；参考：《山东农业大学》2015年硕士论文

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,该病以妊娠母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状为主要特征,并且能破坏猪的免疫系统,引起混合感染或继发感染,给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。病毒的体外分离和鉴定是研究和防治PRRS的基础和前提,而PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性,在体外培养时仅能感染猪肺泡巨噬细胞、猪脾巨噬细胞和源于MA-104的几个亚细胞系(MARC-145、CL2621、HS.2H)。由于最容易感染PRRSV的巨噬细胞难于获得且只能原代培养,操作成本高昂,而且目前常用的MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV,但是存在着PRRSV增殖速度慢、滴度低的局限性,因此建立一种能够快速、高效地增殖PRRSV的细胞系成为当务之急。PRRS侵染宿主细胞的第一步是与细胞上的受体结合,研究表明CD163作为PRRSV的受体介导病毒的脱衣壳和病毒核酸在细胞质内的释放,与PRRSV的感染密切相关,并且Patton等人的研究结果表明PRRSV的感染能力与CD163受体的表达水平具有直接的相关性。因此,本研究旨在构建一株能够稳定、高效表达CD163的MARC-145细胞系,从而能够高效、快速地增殖PRRSV,为PRRSV的相关研究和疫苗开发奠定基础。本研究根据GenBank中收录的相关序列设计引物从PAM(猪肺泡巨噬细胞)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染MARC-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达猪CD163的MARC-145细胞系,命名为pCD163-MARC。间接免疫荧光(IFA)结果显示,构建的pCD163-MARC细胞系中荧光强度明显高于普通MARC-145细胞;Western blot结果显示pCD163-MARC细胞系中pCD163蛋白表达量约为对照MARC-145细胞中pCD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间pCD163蛋白表达量无明显差异。将pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞同时感染1MOI的PRRSV经典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株,测定pCD163-MARC和MARC-145细胞增殖PRRSV的生长曲线实验表明pCD163-MARC细胞增殖两株病毒的滴度有了明显提高。RT-PCR实验亦表明pCD163-MARC细胞增殖的PRRSV的RNA量明显高于MARC-145细胞。在该细胞系的应用方面,我们将本实验室2012.06-2014.06期间RT-PCR检测阳性的PRRSV病料样品120份同时接种pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞,盲传5代后两者对PRRSV的分离率分别为100%和80%,pCD163-MARC细胞显然具有更高的PRRSV分离率,更适合于临床PRRSV的分离培养。我们将pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞扩大至转瓶培养,同时感染1MOI的广东大华农动物保健品股份有限公司生产的PRRS疫苗JXA1-R株,96 h收毒,结果显示病毒在pCD163-MARC细胞上的滴度为1×108.5TCID50/mL,在MARC-145细胞上的滴度为1×107.6TCID50/mL。说明pCD163-MARC细胞比MARC-145细胞具有更强的增殖PRRS疫苗JXA1-R株的能力,可以初步应用于PRRS疫苗毒的生产。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) , commonly known as " porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) , is a highly contagious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus ( PRRS ) . The expression level of pCD163 - MARC was significantly higher than that of normal MARC - 145 cells . The results showed that the expression of pCD163 - MARC was significantly higher than that of normal MARC - 145 cells .

【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】