核因子κB1调控奶牛乳腺上皮细胞乳合成和细胞增殖的作用机理

发布时间：2018-04-14 23:10

本文选题：NFκB1 + 乳合成　；参考：《东北农业大学》2017年博士论文

【摘要】：乳是雌性哺乳动物哺育其初生幼仔生长和发育的天然营养品,同时也是人类生存必不可少的重要食品。乳合成的调控机理是生命科学的重要基础问题之一。探究乳合成相关信号转导途径,寻找调控乳合成的关键信号分子将会为奶牛乳产量和乳品质的提高提供重要的实验依据。营养素和激素通过调控基因的表达,在乳合成方面发挥重要的调节作用,特别是氨基酸在调控乳蛋白合成方面已成为近年来的研究热点。目前,氨基酸和激素调控乳合成方面的研究已经取得一定的成果,但对其调控乳合成分子机制的研究还不够深入。因此,进一步探究乳合成的分子调控机制,完善其分子调控网络是泌乳生物学领域的重要研究内容。核因子κB(nuclear factor ofκB,NFκB)作为真核细胞中重要的转录因子,广泛参与多种基因的表达调控,在细胞增殖与分化、细胞凋亡、免疫应答和炎症反应等方面发挥重要作用,但在泌乳生物学领域的相关研究鲜有报道。本课题以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)为研究基础,通过系统全面的研究,揭示了NFκB1通过PI3K信号途径接受外源信号氨基酸(蛋氨酸)和激素(雌激素),正向调节下游靶基因m TOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1的表达。此外,本研究进一步揭示甘氨酰t RNA合成酶(glycyl t RNA synthetase,Gly RS)能够介导蛋氨酸(methionine,Met)和雌激素(estrogen,E)信号,促进NFκB1磷酸化进而调控BMECs的乳合成和细胞增殖。本研究进一步丰富和完善了乳合成的分子调控网络,为营养素和激素调控乳合成的作用机理提供重要的实验依据。本研究使用的BMECs由组织块培养法分离和纯化获得。用免疫荧光染色法检测BMECs中角蛋白18(Cytokeratin 18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达以鉴定细胞纯度及泌乳能力。在培养液中添加Met(0.6 mmol/L)或E(2.72×10-2μg/L),q RT-PCR和Western blot结果显示,NFκB1的表达量显著上升,p-NFκB1水平显著提高。免疫荧光结果显示,Met和E还能够促进NFκB1入核及磷酸化。研究结果表明,NFκB1可能是介导Met和E促进BMECs乳合成的重要调节因子。对NFκB1基因进行过表达和干扰。q RT-PCR和Western blot结果表明,NFκB1能够正向调控与乳合成和细胞增殖相关的重要信号分子m TOR、SREBP-1c和Cyclin D1的表达,以及提高β-casein和β4Gal-T2的表达水平。进一步研究结果显示,NFκB1基因过表达能够显著促进BMECs甘油三酯和乳糖的合成与分泌以及细胞增殖;而NFκB1基因干扰后,细胞合成与分泌甘油三酯和乳糖的水平及细胞增殖能力显著降低。此外,对NFκB1基因过表达和干扰后BMECs中合成的脂滴进行BODIPY染色,实验结果显示,NFκB1能够促进细胞内脂滴的合成,与上述结果一致。以上研究结果表明,NFκB1能够正向调控BMECs的乳合成及细胞增殖。采用生物信息学手段,对mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1转录起始位点上游2000 bp的启动子区域进行分析,发现这些基因的启动子区域均可能含有NFκB1结合位点(κB序列)。染色质免疫共沉淀(Ch IP)结果证实NFκB1与这些基因的启动子存在结合。Ch IP-q PCR结果显示,添加Met和E后,NFκB1与靶基因启动子的结合显著升高。以上研究结果表明,Met和E能够激活NFκB1并通过提高其与靶基因启动子的结合,在转录水平上调控乳合成和细胞增殖相关基因的表达。为了探究NFκB1接受Met和E信号的分子机制,实验进一步检测了在添加PI3K抑制剂(wortmannin)和m TOR抑制剂(rapamycin)分别抑制PI3K和m TOR信号途径后,NFκB1的表达与激活情况。结果显示,抑制PI3K途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平显著下降,而抑制mTOR途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平无显著变化。进一步研究发现,在添加Met或E同时抑制PI3K途径后,Met和E对NFκB1表达的促进作用被明显削弱。研究结果表明,Met和E通过PI3K途径激活NFκB1。此外,对Gly RS介导Met和E信号促进NFκB1磷酸化的分子机制进行了研究。观察过表达Gly RS及同时利用si RNA干扰NFκB1后,对下游靶基因mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1表达的影响;以及观察添加Met或E同时利用si RNA干扰Gly RS后,对NFκB1磷酸化的影响。研究结果表明,Gly RS介导了Met和E促进NFκB1磷酸化的作用,以及Gly RS主要通过NFκB1调节mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。进一步观察利用si RNA干扰Gly RS同时干扰GCN2对NFκB1基因表达和磷酸化的影响。研究结果表明,Gly RS促进NFκB1磷酸化的作用与GCN2途径及NFκB1基因表达无关。本实验室其它研究工作表明Gly RS直接结合和促进NFκB1磷酸化,与本研究结果一致。综上所述,NFκB1作为重要的转录因子能够正向调控BMECs的乳合成和细胞增殖。Met和E通过PI3K途径和Gly RS激活NFκB1。p-NFκB1通过与靶基因m TOR、SREBP-1c、β4Gal-T2和Cyclin D1启动子的结合,在转录水平上调控这些靶基因的表达。
[Abstract]:In this study , it is important to study the molecular mechanism of milk synthesis and to improve its molecular control network , which is an important research topic in the field of lactation biology . The results showed that NF - 魏B could promote the synthesis and secretion of BMECs and increase the expression of 尾 - casein and 尾 - 4Gal - T2 . The results showed that NF - 魏B could regulate the expression of NF - 魏B and the expression of 尾 - casein and 尾 - 4Gal - T2 . The effects of Gly RS on the phosphorylation of NF - 魏B were studied . The results showed that Gly - RS - mediated phosphorylation of NF - 魏B was not related to the expression of NF - 魏B and the expression of NF - 魏B in GCN2 pathway .

【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

【参考文献】