慢病毒介导siRNA抑制1型鸭肝炎病毒复制

发布时间：2018-04-15 20:29

  本文选题：鸭病毒性肝炎 + GDD模体　； 参考：《畜牧兽医学报》2017年03期

【摘要】：为筛选能抑制DHAV-1复制的siRNA,探索RNAi技术在鸭病毒性肝炎防治中的应用,采用PCR法扩增DHAV-1 RdRp基因,并构建pEGFP-RdRp融合表达EGFP-RdRp蛋白;根据RdRp的序列测定结果,设计3条RdRp特异siRNA,并合成相应shRNA分别插入pmiRZipΔ中构建pRdRp-shRNA;共转染pRdRp-shRNA和pEGFP-RdRp于HEK-293T细胞,通过荧光显微镜法、流式细胞术、相对荧光定量PCR法筛选抑制效率较高的siRNA;将高效siRNA用于病毒载体pmiRZip介导的慢病毒制备;通过计算重组慢病毒转导、DHAV-1感染的鸭胚胎成纤维细胞中病毒TCID50和RdRp基因表达量确定siRNA对病毒及病毒基因的抑制作用。结果显示,3个siRNA均能抑制RdRp基因的表达,包含GDD模体的shRNA2的抑制率最高,对应重组病毒能使DHAV-1的TCID50下降6.2lg,RdRp基因转录量下降89.6%,抑制时间至少达120h,为鸭病毒性肝炎临床防治提供了新思路。
[Abstract]:In order to screen siRNAs that can inhibit DHAV-1 replication, and to explore the application of RNAi technology in the prevention and treatment of duck viral hepatitis, the DHAV-1 RdRp gene was amplified by PCR method, and pEGFP-RdRp fusion was constructed to express EGFP-RdRp protein.Three RdRp specific siRNAs were designed, and the corresponding shRNA was inserted into pmiRZip 螖 to construct pRdRp-shRNAs. PRdRp-shRNA and pEGFP-RdRp were co-transfected into HEK-293T cells.Relative fluorescence quantitative PCR was used to screen siRNAs with high inhibition efficiency, and efficient siRNA was used to prepare lentivirus mediated by viral vector pmiRZip.By calculating the expression of TCID50 and RdRp genes in DHAV-1 infected duck embryonic fibroblasts infected by recombinant lentivirus, the inhibitory effect of siRNA on virus and virus genes was determined.The results showed that all three siRNA could inhibit the expression of RdRp gene, and the shRNA2 containing GDD motifs had the highest inhibition rate.The corresponding recombinant virus can reduce the TCID50 of DHAV-1 by 89.6% of the transcription of RdRp gene and the inhibition time of 120h, which provides a new idea for clinical prevention and treatment of duck viral hepatitis.
【作者单位】： 江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室;
【基金】：2016年度江苏省高校自然科学研究面上资助项目(16KJB230004) 江苏省“六大人才高峰”第十二批培养对象资助项目(NY-023,10410015002) 江苏省大学生创新创业训练计划校企合作基金项目(201612806030H)
【分类号】：S852.65

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