伪狂犬病毒多肽抗体的制备及神经元体外培养研究

发布时间：2018-04-16 01:02

  本文选题：伪狂犬病毒 + 多肽抗体　； 参考：《华中农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是猪α疱疹病毒。PRV侵入外周神经系统并在其中建立可再激活的感染。病毒通过轴突进入细胞核后(逆向运输),病毒基因一般在细胞核内建立潜伏感染。经过数月甚至数年之后,潜伏感染可以再次被激活,产生新组装的病毒颗粒。随后病毒又运输至外周神经系统(顺向运输),在外周神经系统附近再次感染的上皮细胞会产生感染性的病毒颗粒来感染幼小的宿主。病毒颗粒长距离的顺向和逆向的运动需要依赖轴突中微管的快速运输机制。PRV通过受体介导膜融合进入轴突,这个时候病毒分离为病毒囊膜、糖蛋白、外层被膜蛋白和内层被膜蛋白。有一些病毒成分在轴突中是单独运输的,这种运输影响细胞内的潜伏性感染或者增殖性感染。为了能更进一步的研究PRV在神经细胞与上皮细胞之间的方向性传输,Ch’ng和Enquist发明了三室培养系统(triple-chamber system),这种系统将神经元细胞体与轴突通过物理性的隔离而隔开。随后又出现了另外一种不同于三室培养系统的微流体系统(microfluidic chamber system),可以被用做研究α疱疹病毒的蛋白对病毒在神经细胞轴突运输中的影响。由以上研究背景,本试验通过设计多肽并注射到长耳兔,从而获得PRV gB、VP16、VP26蛋白的高免血清。分离并培养鸡胚脊髓背根神经元和新生小鼠海马神经细胞。在微流体系统(microfluidic chamber system)中体外原代培养鸡胚脊髓背根神经元,在轴突端或者胞体端接种PRVΔUL21-EGFP重组病毒。在一定时间内收获轴突端和胞体端的培养基,并分别测其毒价。通过分析轴突端和胞体端样品毒价从而确定PRV被膜蛋白UL21在轴突顺行及逆行运输的作用。主要工作包括:1.多抗的制备根据gB、VP16、VP26蛋白的氨基酸序列,找出一段适合的序列设计多肽。将设计的多肽序列送公司合成。合成好的多肽溶液与弗氏佐剂混合注射至新西兰长耳兔。免疫数次后用ELISA检测血清的效价,达到要求后,对长耳兔进行颈动脉采血。对血液进行离心并吸取上清,上清即为所需的血清。Western blot检测所得到的血清。经过检测后,这三种血清均含有相应蛋白的抗体。2.小鼠海马神经元的原代培养选取出生24 h以内的新生小鼠,在解剖显微镜下分离获取脑部的海马组织。用即配的浓度为2 mg/ml木瓜蛋白酶消化成单个的细胞,接种在六孔板或者小皿中,每三天换液一次,一次更换三分之一,每次换液需提前预热培养基。培养10天左右进行观察。通过间接免疫荧光验证所培养的细胞为小鼠海马神经元.。3.微流体系统的建立及重组病毒的接种使用微流体系统(microfluidic chamber system)进行鸡胚脊髓背根神经元的原代培养,神经元种植在微流体系统的一个室(胞体室)中,轴突通过细微纹沟伸展至另一个室(轴突室)中。鸡胚脊髓背根神经元在胞体室中培养5 d后轴突即可通过细微纹管生长至轴突室中。将构建好的重组病毒按一定的MOI接入轴突室或胞体室,在一定的时间点测定轴突室和胞体室的毒价。结果表明微流体系统能够很好地研究伪狂犬病毒逆行和顺行运输过程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1756582