BMP1基因在动物卵泡发生过程中的表达模式及功能的初步研究

发布时间：2018-04-29 06:05

  本文选题：BMP1 + 表达模式　； 参考：《广西大学》2015年博士论文

【摘要】：动物卵泡发生调控的分子机制是发育生物学研究的热点问题。有研究表明,骨形态发生蛋白(BMPs)家族广泛参与动物卵泡发生调控的过程,其中BMP1基因与TGF-β家族的BMP2-7基因不同,BMP1是具有独特蛋白结构域的金属蛋白酶,属于虾红素家族。最新报道显示,BMP1基因在绵羊卵泡发生过程中亦有表达,但其在动物卵泡发生中的表达模式和功能仍待深入探索。本研究以单胎大家畜水牛、多胎家畜猪和多胎试验动物小鼠为模型,系统研究BMP1基因在卵泡发生各时期和早期胚胎发育时期表达模式,并通过卵泡颗粒细胞、体外成熟卵母细胞和活体卵巢试验,探讨其发挥调控卵泡发育的分子机制。取得如下结果：1.水牛BMP1基因克隆与生物信息分析以GenBank数据库中牛的BMP1 (XM_002689771.1)为参考序列设计合成特异性扩增引物,以水牛卵巢组织总RNA为模板,应用RT-PCR成功扩增获得编码水牛BMP1基因cDNA序列。测序结果表明：水牛BMP1基因的cDNA序列长3195 bp,包含完整的2967 bp的开放读码框,编码989个氨基酸,蛋白分子量为111.5 kDa,等电点为7.08。序列相似性分析结果显示水牛BMP1基因与牛、绵羊、猪、人和小鼠BMP1基因的核苷酸序列相似性分别为99%、98%、93%、91%和89%,氨基酸相似性分别为99%、97%、96%、95%和95%,进一步构建系统进化树表明BMP1基因在动物进化过程中具有高度的保守特性。蛋白结构域分析显示水牛BMP1基因具有显著的HELGHVIGFWHE锌离子结合域和保守的Met-turn SIMHY区,含有一个前蛋白区,一个锌离子结合区、五个CMB和两个EGF-Like功能区,与其他物种BMP1基因的结构域相同或相似,成功克隆了一种水牛物种的新型金属蛋白酶。2.BMP1基因在水牛卵泡发生过程中的表达模式研究首先通过实时荧光定量PCR (QRT-PCR)和Western Blotting分析了BMP1基因在水牛不同组织器官中的表达模式及规律。结果显示,BMP1基因在水牛胎儿时期不同组织中都有表达且差异显著(P0.05),其中在心脏中表达最高,卵巢和睾丸次之。此外,Western Blotting结果发现,BMP1基因以不同剪切体的形式存在于水牛不同的组织当中。分离不同直径的水牛卵泡,QRT-PCR检测结果显示,BMP1基因在卵泡中的表达呈现随着卵泡直径的增大而逐渐升高的趋势,在3-4.5 mm直径卵泡中表达量最高,且不同直径卵泡间BMP1基因的表达差异显著(P0.05)。免疫组化分析结果显示,BMP1基因从水牛胎儿时期的卵巢,以及到性成熟之后的水牛的卵巢中的不同发育时期的卵泡中都有不同程度的表达,并主要表达于卵母细胞和颗粒细胞中。免疫荧光检测结果显示,BMP1基因特异性的定位于颗粒细胞中和卵母细胞的膜上。QRT-PCR检测结果发现,BMP1基因在水牛成熟后COCs (卵丘卵母细胞复合体)和卵母细胞中表达量高于成熟前,且BMP1基因在COCs中的表达显著高于裸卵(P0.05)。3.BMP1基因调控体外培养水牛颗粒细胞生长和卵泡发生的机制研究在水牛颗粒细胞培养液中添加不同浓度的BMP1重组蛋白和BMP1抗体,以研究BMP1基因对颗粒细胞增殖以及相关因子表达变化的影响。结果显示：BMP1基因在体外培养水牛颗粒细胞中的表达随着培养时间的延长而显著增加(P0.05),在体外培养96h时达到最高。添加BMP1重组蛋白(25 ng/mL)显著促进颗粒细胞的增殖(P0.05),提高颗粒细胞的S期细胞比例,并能够抑制颗粒细胞的凋亡(P0.05)。BMP1重组蛋白(25 ng/mL)还可以显著上调TGF-β信号通路中配体BMP2、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因,受体如BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-Ⅱ和TGF-PR1-3等基因(P0.05),以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad4、Smad5等基因的表达(P0.05)。此外BMP1重组蛋白(25 ng/mL)可以显著抑制三大细胞凋亡信号通路如线粒体通路如Cytochrome C、Apaf1,死亡受体通路如TNFα、TNFR1、Fas、FasL等,内质网通路如Chop、Bax等促凋亡相关基因的表达,以及抑制Caspase家族Caspase-3、 Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的表达(P0.05)。进一步研究表明,BMP1重组蛋白(25 ng/mL)还显著上调与卵泡选择和优势化相关基因如VEGFR1、VEGFR2、PAPP-A、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR等基因的表达(P0.05),而添加BMP1抗体得到了相反的结果,并且随着抗体浓度的增加(0～400 ng/mL),各基因的表达显著下调或者显著上调(P0.05),并显示出剂量依赖效应。4.BMP1基因在猪卵泡发生及早期胚胎发育中的表达模式和功能的初步研究首先采用QRT-PCR分析了BMP1基因在猪不同直径卵泡中的表达规律。结果显示,BMP1基因在1-2 mm直径的卵泡中表达量最低,在4.5-6.5 mm直径的卵泡中表达量最高,并随着猪卵泡直径的增大其表达量逐渐上升,且差异显著(P0.05)。免疫组化分析结果显示,BMP1基因在猪不同发育时期的卵泡中,从初级卵泡到格拉夫氏卵泡中都存在不同程度的表达,并主要表达于卵母细胞和颗粒细胞中。免疫荧光结果显示,BMP1基因在猪成熟前后卵母细胞和卵丘卵母细胞复合体中,以及早期孤雌胚胎的发育过程中都有表达,并且特异性的表达于颗粒细胞膜中。QRT-PCR结果显示,BMP1基因在猪成熟后COCs和卵母细胞中表达量显著高于成熟前(P0.05),QRT-PCR和Western Blotting结果分析得知BMP1基因在猪早期孤雌胚胎中的表达呈现递增的趋势,2细胞时期表达最低,在8细胞时期达到最高,囊胚期显著下降(P0.05)。通过在体外培养的猪卵母细胞培养基中分别添加不同浓度的BMP1重组蛋白或者抗体,发现BMP1重组蛋白(25 ng/mL)可以显著提高体外卵母细胞成熟效率,胚胎分裂率,囊胚率和囊胚细胞数(P0.05)。而抗BMP1抗体添加组(0-400ng/mL)则显示了相反的结果,且结果呈现一定的剂量依赖效应。当添加300 ng/mL和400 ng/mL的抗BMP1抗体时,体外培养的卵母细胞出现死亡。5.BMP1基因在小鼠卵泡发生过程中的表达模式和功能的研究应用雌性昆明小鼠作为模式动物,研究BMP1基因在体内卵泡发生中的表达模式及功能。QRT-PCR结果发现,BMP1基因在不同周龄小鼠的卵巢中都有表达,且差异显著(P0.05),并于6 W小鼠的卵巢中表达最高。通过免疫组化技术对BMP1基因在8d、3W、6W、11W和15W小鼠体内卵巢进行定位研究结果显示,BMP1基因在’8d、3W、6W、11W和15W小鼠的卵巢中各卵泡发育阶段中均有表达,并特异性地表达于颗粒细胞,在黄体中不表达。随后注射BMP1基因特异性抑制剂检测卵泡发生相关基因的表达变化、卵巢形态变化、卵巢内卵泡发育形态,以及卵巢内颗粒细胞的凋亡情况。结果显示,小鼠注射BMP1抑制剂后,卵巢内卵泡的发育明显减少,并停滞在初级卵泡阶段。此外,卵巢内颗粒细胞的凋亡显著增多(P0.05)。QRT-PCR结果显示,注射BMP1抑制剂后可以显著抑制卵巢中TGF-β信号通路中配体BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因、受体如BMPR-IB、BMPR-Ⅱ和TGF-βR1-3等基因,以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad5和Smad8等基因的表达(P0.05),上调Follistatin、AMH、Smad6和Smad7的表达。此外三大细胞凋亡信号通路如线粒体通路如Cytochrome C、Apaf1,死亡受体通路如Fas和FasL等促凋亡相关基因的表达出现显著上调(P0.05)的表达显著升高(P0.05)。卵巢中与卵泡选择和优势化相关基因如IGF-II、IGF-IR和IGF-IIR等基因的表达显著下调(P0.05)。结论：BMP1基因在水牛、猪和小鼠的卵泡发生过程中均有不同程度的表达,BMP1基因主要通过调控颗粒细胞的增殖与凋亡,并通过影响TGF-P信号通路和细胞凋亡信号通路等相关因子的表达而调控动物的卵泡发育,并且主要影响动物卵泡的选择和优势化过程。
[Abstract]:The molecular mechanism of BMP1 gene was cloned and analyzed . The molecular mechanism of BMP1 gene was 99 % , 98 % , 93 % , 91 % and 95 % , respectively . The expression of BMP1 gene was higher than that of naked eggs ( P0.05 ) . The results showed that the expression of BMP1 gene was higher than that of naked eggs ( P0.05 ) . The expression of BMP1 gene in the follicles of pigs with different developmental stages was significantly higher than that before maturation ( P0.05 ) . The results showed that the expression of BMP2 , BMP3 , BMP4 , BMP6 , BMP15 , GDF9 and TGF - 尾R1 - 3 and the expression of Smad protein , such as BMPR - IB , BMPR - 鈪，

本文编号：1818700